Procedimiento para la preparación de inmunoglobulinas para administración intravenosa y otros productos inmunoglobulínicos.

Un procedimiento para purificar inmunoglobulina G (IgG) a partir de una fracción proteica plasmática crudaque contiene inmunoglobulina,

en donde el procedimiento comprende las etapas de:

(a) preparar una suspensión acuosa de la fracción proteica plasmática cruda que contiene inmunoglobulina,de modo que la concentración de IgG en la suspensión acuosa sea de al menos aproximadamente 4 g/l, elpH de la suspensión que contiene inmunoglobulina está dentro del intervalo de 5,1 a 5,7 y la suspensiónque contiene inmunoglobulina se filtra adicionalmente mediante filtración en profundidad;

(b) añadir un agente precipitante de proteína, sustancialmente no desnaturalizante, hidrosoluble a dichasuspensión filtrada de la etapa (a) en una cantidad suficiente para causar la precipitación de una elevadaproporción de proteínas no inmunoglobulinas G, inmunoglobulinas agregadas y partículas incluyendo partículaspotencialmente infecciosas tales como partículas víricas, sin causar una precipitación sustancial de lainmunoglobulina G monomérica, formando de esta manera una mezcla de precipitado sólido y material sobrenadantelíquido; en donde el agente precipitante es PEG 3350, PEG 4000 o PEG 6000 dentro del intervalode 4 a 10% en peso e incubar desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 12 horas atemperatura entre 2ºC y 8ºC;

(c) clarificar y recuperar un material sobrenadante que contiene inmunoglobulina G a partir de la mezcla dela etapa (b); y filtrar en profundidad el material sobrenadante clarificado para eliminar las partículas y agregadosde gran tamaño;

(d) aplicar el material sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G de la etapa (c) a una resinaDEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) y posteriormente a una resina CM Sepharose Fast Flow (CM), en dondela resina DEAE y la resina CM están conectadas en serie y en donde el tampón utilizado para la cromatografíaDEAE y la CM es el mismo tampón, el pH de dicho tampón está en el intervalo de 5,4 a 5,9 y laconductividad está en el intervalo de 1,0 a 1,4 mS/cm, lavar con un volumen de columna de un tampón delavado y a continuación desconectar las columnas DEAE y CM;

(e) eliminar por lavado los contaminantes proteicos y las proteínas precipitadas procedentes de la resinaCM de la etapa (d) con un tampón que tiene un pH y una fuerza iónica suficientes para eliminar los contaminantesde la resina sin causar una elución sustancial de la inmunoglobulina G, en donde el tampón tieneun pH entre 5,2 y 5,8;

(f) eluir la inmunoglobulina G desde la resina CM de la etapa (e) con un tampón sustancialmente no desna30turalizante que tiene un pH y una fuerza iónica suficientes para causar una elución eficaz de la inmunoglobulinaG, recuperando de esta manera un eluido que contiene inmunoglobulina G; en donde la elución serealiza como una etapa con gradiente de elución desde aproximadamente 125 mM a aproximadamente 350mM de cloruro sódico y un pH en el intervalo de 5,2 a 5,8;

(g) realizar una diafiltración/ultrafiltración con el eluido que contiene inmunoglobulina G de la etapa (f) paraconcentrar y/o dializar el eluido hasta que la conductividad de la solución ultrafiltrada se reduzca a un valorinferior a aproximadamente 1,3 mS/cm y en donde el pH se mantiene dentro del intervalo de 4,0 a 6,0, yopcionalmente añadir un agente estabilizante;

(h) realizar una etapa de inactivación de virus, y

(i) si se desea, someter la solución purificada que contiene IgG a tratamientos adicionales con el fin deadaptarla a una formulación como producto líquido.

Procedimiento para la preparación de inmunoglobulinas para administración intravenosa y otros productos inmunoglobulínicos Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar inmunoglobulinas, es decir, inmunoglobulina G (IgG) , a partir de plasma crudo o de una fracción proteica de plasma crudo. La invención también se refiere a un producto inmunoglobulínico y al uso de tal producto inmunoglobulínico para fines médicos.

Antecedentes de la invención La inmunoglobulina normal humana (INH) para uso en la prevención y el tratamiento de una serie de enfermedades infecciosas, se introdujo en la década de 1940. Las INHs preparadas por el método de fraccionamiento con etanol frío según Cohn & Oncley (Cohn E. et al., (1946) , J Am Chem Soc, 68, 459-475) , (Oncley et al., (1949) , J Am Chem Soc, 71, 541-550) y subsecuentemente también por la modificación hecha por Kistler y Nitschmann (Kistler P y Nitschmann HS, (1952) , Vox Sang, 7, 414-424) demostraron ser eficaces y estar protegidas contra la transmisión de infecciones víricas, cuando se administraban por vía subcutánea o intramuscular.

La falta de inmunoglobulina congénita o adquirida, total o parcial (síndrome de inmunodeficiencia primario y secundario, respectivamente) se manifiesta a través de frecuentes infecciones comunes y graves, especialmente de naturaleza bacteriana. La prevención de tales infecciones se logró previamente mediante inyecciones intramusculares o subcutáneas repetidas de grandes cantidades de INH, hasta varias veces a la semana, como un tratamiento de por vida, lo cual es muy doloroso cuando el medicamento se administra por vía intramuscular.

Por ello, al principio de la década de los 60 se intentó la administración de INH por vía intravenosa. Los ensayos mostraron que aproximadamente el 5% de los voluntarios sanos y aproximadamente el 95% de los pacientes con una deficiencia en inmunoglobulinas, desarrollaba efectos adversos inmediatos que variaban desde disnea hasta choque circulatorio y que eran de naturaleza tan grave que la administración intravenosa de INH tuvo que ser abandonada.

La razón de los efectos adversos anteriormente mencionados, se debía a agregados de inmunoglobulinas que, entre otros efectos, activaban fuertemente el sistema del complemento. Esto se observó particularmente en pacientes que carecían de inmunoglobulinas. Se pudieron observar efectos adversos especialmente graves de naturaleza anafiláctica en pacientes que desarrollaron anticuerpos contra IgA. En consecuencia, se desarrollaron métodos para evitar la formación de agregados y/o para eliminar estos agregados durante el proceso de preparación, y hace unos veinte años se sometió a ensayo la primera generación de una inmunoglobulina para administración intravenosa (IGIV) y se encontró adecuada.

La finalidad original de una IGIV era aliviar los episodios infecciosos en pacientes con una falta de inmunoglobulinas congénita o adquirida, total o parcial, y eliminar los malestares relacionados con la administración de INH. Otra ventaja de la IGIV es que se pueden administrar grandes dosis de inmunoglobulina en un corto tiempo, por lo cual es posible obtener de manera muy rápida, concentraciones sanguíneas suficientemente altas. Especialmente cuando se tratan infecciones bacterianas graves, es importante establecer concentraciones elevadas de forma rápida en los sitios de la infección.

En los últimos años, la IGIV ha mostrado ser eficaz en otras enfermedades graves, cuyo tratamiento podría ser complicado de otra manera, p. ej., hemorragias causadas por la desaparición de las plaquetas sanguíneas sobre una base inmunológica, la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) , en algunas enfermedades raras tales como el síndrome de Kawasaki y una variedad de enfermedades autoinmunitarias tales como la polirradiculitis (síndrome de Guillain-Barré) . Otras enfermedades cuyo tratamiento ha sido difícil hasta la actualidad están siendo sometidas a ensayos clínicos con IGIV. El mecanismo de acción en estas enfermedades solo se ha esclarecido parcialmente. El efecto se supone que está relacionado con las denominadas propiedades inmunomoduladoras de la IgG, p. ej., un bloqueo de los receptores de Fcy de las células fagocíticas, un incremento del metabolismo de IgG, una regulación a la baja de la producción de citocinas y una interferencia con una supuesta red de idiotipos/antiidiotipos, especialmente relevantes para la neutralización de la reactividad autoinmunitaria.

La primera generación de IGIV se preparó mediante la escisión con pepsina del material de partida (fracción II de Cohn) , siendo el propósito de la escisión retirar los agregados de inmunoglobulina. No se incluyeron en el proceso etapas de cromatografía en columna. El producto tenía que ser liofilizado con el fin de permanecer estable durante un periodo de tiempo razonable y se disolvía inmediatamente antes de su uso.

El material de partida para la IGIV era INH que había demostrado estar protegida con respecto a la transmisión de virus cuando se utilizaba para inyección intramuscular. Así pues, la IGIV se consideró que estaba protegida. Sin embargo, después de varios años de uso clínico, los productos de IGIV procedentes de algunos fabricantes, mostraron sorprendentemente que causaban la transmisión de una infección con virus de la hepatitis C.

Estudios para esclarecer el destino de los virus durante la producción de INH, mostraron que la eliminación del virus en el proceso de fraccionamiento desde plasma a INH, no es muy buena. La protección de las INH para uso intramuscular, es probable que se deba al hecho de que contienen inmunoglobulinas protectoras. En combinación con el modesto volumen inyectado y la vía de administración intramuscular, estas inmunoglobulinas protectoras pueden neutralizar virus comunes en plasma y volverlos no infecciosos. Las infecciones víricas pueden tener lugar especialmente cuando se administran grandes dosis de inmunoglobulinas por vía intravenosa, tal como fue demostrado al principio de la década de 1990. Por lo tanto, se reconoció que los procedimientos de producción deberían comprender una o varias etapas bien definidas de inactivación y/o eliminación de virus.

Una segunda generación de IGIV basada en moléculas de inmunoglobulina sin escindir y sin modificar con baja actividad anticomplementaria y estabilidad elevada, se introdujo a mediados de los 80, pero todavía en forma de producto liofilizado. Esta IGIV se purificaba mediante varias etapas cromatográficas. Los productos de este tipo dominan actualmente el mercado de IGIV. La primera y la segunda generación de IGIV aparecen, por lo tanto, en forma de polvos liofilizados que se disuelven inmediatamente antes de su uso.

La disolución de la IGIV liofilizada es lenta (hasta 30 minutos para un frasco) . Frecuentemente, se tienen que disolver varias porciones para un paciente. Como es de alta prioridad para los usuarios tener una IGIV en una solución lista para su uso, se han introducido productos líquidos en el mercado. Lo que es más importante, todavía existe una necesidad de mejorar el procedimiento de producción con el fin de obtener una preparación de IGIV altamente purificada, estable y completamente natural, con mayor eficacia clínica y menos reacciones adversas a los fármacos. Por lo tanto existe una necesidad de un procedimiento adicionalmente desarrollado y mejorado para purificar IgG a partir de plasma crudo o de una fracción proteica plasmática, para obtener un producto de IGIV líquido protegido contra los virus. Finalmente, el procedimiento se debe diseñar de tal manera que pueda ser utilizado en una producción a gran escala.

El procedimiento de purificación descrito en la presente solicitud, lleva a obtener un producto inmunoglobulínico líquido para administración intravenosa que se puede caracterizar como una nueva generación de IGIV altamente purificada, completamente natural, biológicamente activa, doblemente inactivada contra virus y estable, la cual no contiene como estabilizante ningún detergente, polietilenglicol (PEG) o albúmina.

Los documentos WO-A-8606727, WO-A-9429334 y US-A-4296027 describen métodos alternativos para la preparación de inmunoglobulinas.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento de purificación mejorado y a un producto inmunoglobulínico líquido mejorado el cual, entre otras cosas, se puede administrar por vía intravenosa.

Un producto inmunoglobulínico obtenido por el método de la presente invención, se podría denominar IGIV de tercera generación. El procedimiento se caracteriza por las siguientes condiciones para el fraccionamiento: se evita la escisión con... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para purificar inmunoglobulina G (IgG) a partir de una fracción proteica plasmática cruda que contiene inmunoglobulina, en donde el procedimiento comprende las etapas de:

(a) preparar una suspensión acuosa de la fracción proteica plasmática cruda que contiene inmunoglobulina,

de modo que la concentración de IgG en la suspensión acuosa sea de al menos aproximadamente 4 g/l, el pH de la suspensión que contiene inmunoglobulina está dentro del intervalo de 5, 1 a 5, 7 y la suspensión que contiene inmunoglobulina se filtra adicionalmente mediante filtración en profundidad;

(b) añadir un agente precipitante de proteína, sustancialmente no desnaturalizante, hidrosoluble a dicha suspensión filtrada de la etapa (a) en una cantidad suficiente para causar la precipitación de una elevada 10 proporción de proteínas no inmunoglobulinas G, inmunoglobulinas agregadas y partículas incluyendo partículas potencialmente infecciosas tales como partículas víricas, sin causar una precipitación sustancial de la inmunoglobulina G monomérica, formando de esta manera una mezcla de precipitado sólido y material sobrenadante líquido; en donde el agente precipitante es PEG 3350, PEG 4000 o PEG 6000 dentro del intervalo de 4 a 10% en peso e incubar desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 12 horas a temperatura entre 2ºC y 8ºC;

(c) clarificar y recuperar un material sobrenadante que contiene inmunoglobulina G a partir de la mezcla de la etapa (b) ; y filtrar en profundidad el material sobrenadante clarificado para eliminar las partículas y agregados de gran tamaño;

(d) aplicar el material sobrenadante clarificado que contiene inmunoglobulina G de la etapa (c) a una resina

DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) y posteriormente a una resina CM Sepharose Fast Flow (CM) , en donde la resina DEAE y la resina CM están conectadas en serie y en donde el tampón utilizado para la cromatografía DEAE y la CM es el mismo tampón, el pH de dicho tampón está en el intervalo de 5, 4 a 5, 9 y la conductividad está en el intervalo de 1, 0 a 1, 4 mS/cm, lavar con un volumen de columna de un tampón de lavado y a continuación desconectar las columnas DEAE y CM;

(e) eliminar por lavado los contaminantes proteicos y las proteínas precipitadas procedentes de la resina CM de la etapa (d) con un tampón que tiene un pH y una fuerza iónica suficientes para eliminar los contaminantes de la resina sin causar una elución sustancial de la inmunoglobulina G, en donde el tampón tiene un pH entre 5, 2 y 5, 8;

(f) eluir la inmunoglobulina G desde la resina CM de la etapa (e) con un tampón sustancialmente no desna

turalizante que tiene un pH y una fuerza iónica suficientes para causar una elución eficaz de la inmunoglobulina G, recuperando de esta manera un eluido que contiene inmunoglobulina G; en donde la elución se realiza como una etapa con gradiente de elución desde aproximadamente 125 mM a aproximadamente 350 mM de cloruro sódico y un pH en el intervalo de 5, 2 a 5, 8;

(g) realizar una diafiltración/ultrafiltración con el eluido que contiene inmunoglobulina G de la etapa (f) para concentrar y/o dializar el eluido hasta que la conductividad de la solución ultrafiltrada se reduzca a un valor inferior a aproximadamente 1, 3 mS/cm y en donde el pH se mantiene dentro del intervalo de 4, 0 a 6, 0, y opcionalmente añadir un agente estabilizante;

(h) realizar una etapa de inactivación de virus, y

(i) si se desea, someter la solución purificada que contiene IgG a tratamientos adicionales con el fin de 40 adaptarla a una formulación como producto líquido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de inactivación de virus (h) en la reivindicación 1 comprende las etapas de:

(a) añadir una cantidad viricida de agente inactivador de virus a la fracción dializada/ultrafiltrada que contie

ne inmunoglobulina G y opcionalmente estabilizada de la etapa (g) de la reivindicación 1, obteniéndose co45 mo resultado una solución sustancialmente protegida contra virus que contiene inmunoglobulina G;

(b) aplicar la solución que contiene inmunoglobulina G de la etapa (a) a una resina de intercambio aniónico y subsecuentemente a una resina de intercambio catiónico;

(c) lavar la resina de intercambio catiónico de la etapa (b) con un tampón que tiene un pH y una fuerza ióni

ca suficientes para eliminar por lavado los contaminantes proteicos y el agente inactivador de virus de la re50 sina, sin causar una elución sustancial de la inmunoglobulina G y

(d) eluir la inmunoglobulina G de la resina de intercambio catiónico de la etapa (c) con un tampón sustancialmente no desnaturalizante que tiene un pH y una fuerza iónica suficientes para causar una elución eficaz de la inmunoglobulina G, recuperando de esta manera un eluido que contiene inmunoglobulina G.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por someter el eluido que contiene inmunoglobulina G de la etapa (d) de la reivindicación 2 a diafltración/ultrafiltración para disminuir la fuerza iónica a menos de 1, 0 mS/cm y concentrar la inmunoglobulina G de la solución.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente añadir un 5 agente estabilizante y/o el ajuste de la osmolaridad.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en donde se añaden alcoholes de azúcar, sacáridos, aminoácidos o agentes orgánicos.

6. Un producto de inmunoglobulina líquido obtenible por un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una concentración de IgG desde aproximadamente 1 a 20% en peso y que tiene las siguientes caracterís10 ticas: a) una pureza mayor del 98%, b) un contenido en monómeros y dímeros de IgG mayor del 98, 5%,

c) un contenido en IgA inferior a 6 mg de IgA/L y d) un contenido en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

7. Un producto de inmunoglobulina líquido según la reivindicación 6, que no comprende albúmina como agente estabilizante.

8. Un producto de inmunoglobulina líquido según las reivindicaciones 6 o 7, que contiene menos de 4 mg/L de IgA.

9. Un producto de inmunoglobulina líquido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que contiene entre 20 55 y 65% de IgG1, entre 30 y 40% de IgG2, entre 2 y 5% de IgG3 y entre 1 y 4% de IgG4.

10. Un producto de inmunoglobulina líquido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que contiene menos de 1, 5% de polímeros y agregados.

11. Un producto de inmunoglobulina líquido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, para administración intravenosa instantánea.

12. Un producto de inmunoglobulina líquido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en donde la concentración de IgG es 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20% en peso.

13. Un producto de inmunoglobulina líquido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, para uso en medicina.