Fracciones de inmunoglobulina.

Un método para la fabricación de una composición farmacéutica que comprenda una fracción de anticuerposhumanos de una población heterogénea de donantes humanos,

que consiste en:

(a) someter una preparación de anticuerpos humanos de una población heterogénea de donantes a unfraccionamiento por tamaño,

(b) recuperar la fracción de anticuerpos diméricos, y

(c) monomerizar los anticuerpos diméricos con un peso molecular aparente de aproximadamente 300 kDa.

Fracciones de inmunoglobulina La presente invención se refiere a nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden fracciones de preparaciones de inmunoglobulinas humanas, a nuevas aplicaciones de estas composiciones y a un método para la fabricación de dichas composiciones.

Las preparaciones de inmunoglobulina intravenosa (IGIV) se derivan de plasma acumulado de miles de donantes sanos (los tamaños corrientes de los acumulados varían de 1000-60 000) y contienen anticuerpos inmunes y naturales (NAbs) que reflejan la experiencia antigénica acumulada de la población de donantes. Por lo tanto, IGIV contiene un amplio espectro de los denominados "anticuerpos inmunes" especificidades dirigidas contra patógenos y antígenos extraños así como de NAb que reaccionan con los antígenos propios/autoantígenos. Los NAb se definen así porque se generan en ausencia de inmunización deliberada e independientemente de la exposición a antígenos extraños (1) . De hecho se ha detectado una larga lista de anticuerpos contra antígenos propios e incluso se han purificado por cromatografía de afinidad de preparaciones de IGIV. Estos NAb suelen ser polirreactivos, se pueden unir a los patógenos y mediante marcado y depuración de la circulación de moléculas y células senescentes o alteradas, son importantes en el mantenimiento de la inmunohomeostasis (2) . Además, se ha propuesto que estos NAb reconocen un subconjunto conservado de antígenos inmunodominantes denominado el homúnculo inmunológico que es esencial para mantener la autotolerancia (3) . Sin embargo, no se ha definido una caracterización más precisa de estos anticuerpos, sus propiedades y su posible presencia en una subfracción de la IGIV en parte debido a la escasez de conocimientos sobre los antígenos y anticuerpos blanco pertinentes.

Las aplicaciones terapéuticas actuales de IGIV cubren 2 categorías principales: i) reemplazo de anticuerpos en deficiencias de anticuerpos primarios y secundarios (4) ii) inmunomodulación en los pacientes con enfermedades inflamatorias sistémicas y autoinmunitarias (2, 5) . Si bien IGIV ha demostrado eficacia clínica en las deficiencias de anticuerpos y en algunas enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias [ (por ejemplo púrpura trombocitopénica inmunitaria (PTI) , síndrome de Guillain Barré (SGB) , enfermedad de Kawasaki, Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica (PDIC) ] hay muchos ejemplos de beneficios clínicos no confirmados/equívocos en otras afecciones autoinmunitarias e inflamatorias sistémicas a menudo debido a la falta de ensayos controlados que sean estadísticamente significativos.

El modo de acción de IGIV es complejo e involucra modulación de la expresión y la función de los receptores Fc, interferencia con la activación del complemento y la red de citocinas, modulación de la activación, la diferenciación y las funciones, efectoras en muchos tipos de células diferentes. Se ha propuesto la red de idiotipos como una red esencial implicada en la homeostasis inmunitaria con desequilibrios que eventualmente llevan a enfermedad autoinmunitaria ostensible. Muchas de las indicaciones terapéuticas actuales para la IGIV se basan en contrarrestar, neutralizar o bloquear anticuerpos autoinmunes patológicos y así restaurar una red de idiotipos sanos (6, 7) . Los informes recientes también han demostrado efectos directos sobre los monocitos, las células dendríticas, endoteliales y los linfocitos tanto T como B . Esta complejidad refleja las funciones esenciales de los anticuerpos circulantes para mantener la homeostasis en los individuos sanos (2, 8) .

Hay muchos informes en la bibliografía que demuestran la disminución de la reactividad inmunitaria con la edad, denominada inmunosenescencia (9) . Sin embargo, parece que hay una estabilidad de vida larga de los anticuerpos IgG naturales que reaccionan con los antígenos propios en comparación con una diversificación dependiente de la edad de repertorios de anticuerpos IgG para los antígenos extraños con el aumento de la edad (10) .

IGIV consiste en moléculas de IgG intactas con una distribución de isotipos de IgG correspondiente a la del suero humano normal y cantidades muy pequeñas de IgA. Dependiendo de la formulación, las preparaciones de IGIV contienen cantidades variables de IgG monomérica y dimérica. Los monómeros representan la IgG monomérica (aprox. peso molecular 150 000) mientras que los dímeros representan 2 moléculas de IgG las cuales a partir de los datos previos se pueden orientar como pares de idiotipo antiidiotipo clásicos (11) .

EP-A-1394183 da a conocer un método para purificar autoanticuerpos de preparaciones de IGIV mediante cromatografía de afinidad en un ligando, por ejemplo una mezcla de proteínas presentes en el suero humano diferentes de la inmunoglobulina unida a un soporte sólido.

La patente de Estados Unidos 6, 231, 856 da a conocer composiciones de anticuerpos humanos que comprenden anticuerpos antiidiotípicos sustancialmente purificados y concentrados o sus fragmentos de unión al antígeno, para el tratamiento basado en anticuerpos de enfermedades autoinmunitarias. Las composiciones de anticuerpos se obtienen por cromatografía de afinidad.

Según la presente invención, se encontró que un fraccionamiento del tamaño de una preparación de inmunoglobulinas humanas da una fracción de anticuerpos diméricos y una fracción de anticuerpos monoméricos, que tienen características diferentes. La fracción dimérica muestra una mayor reactividad a los antígenos, por ej., los autoantígenos y/o los exoantígenos. Además, la fracción dimérica contiene anticuerpos con mayor afinidad por los antígenos blanco y por lo tanto puede tener una mayor actividad biológica, por ej., actividad neutralizante en el caso de actividades antibacterianas, antitoxinas o antivirales. En contraste, la fracción monomérica puede contener anticuerpos de menor afinidad, por ejemplo, anticuerpos naturales, es decir, el repertorio básico del cual se desarrollan los anticuerpos de alta afinidad.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una fracción de anticuerpos humanos o sus fragmentos de unión al antígeno de una población heterogénea de donantes humanos donde la fracción se origina de los anticuerpos diméricos humanos.

Las fracciones se pueden obtener de cualquier preparación que comprenda una preparación de anticuerpos policlonales humanos de múltiples donantes. Preferentemente, las fracciones se obtienen de una preparación de IGIV.

En este contexto, una preparación de IGIV es una preparación de inmunoglobulinas humanas que se puede derivar del plasma acumulado de múltiples por ej. 1000100 000 donantes de sangre. Los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos se pueden obtener por métodos conocidos, por ejemplo por digestión proteolítica. Los fragmentos de anticuerpos preferidos son los fragmentos Fab o F (ab') 2.

Las fracciones monoméricas o diméricas se pueden obtener mediante fraccionamiento por tamaño de las preparaciones de anticuerpos humanos. El fraccionamiento por tamaño puede comprender: separación de exclusión por tamaño, filtración en gel, ultrafiltración, diafiltración u otros métodos de separación en gel o membrana. La fracción monomérica se puede obtener mediante recuperación de monómeros de anticuerpos con un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kDa y la fracción dimérica se puede obtener mediante recuperación de dímeros de anticuerpos con un peso molecular aparente de aproximadamente 300 kDa.

Preferentemente, el fraccionamiento por tamaño comprende cromatografía de exclusión por tamaño, por ejemplo, en una columna Superose 6 o una Sephacr y l S-300.

La pureza de las fracciones monomérica y dimérica obtenidas mediante fraccionamiento por tamaño se puede medir por HPLC analítica, por ej. cromatografía de exclusión por tamaño en una columna TSK G 3000 SWXL.

La pureza de la fracción dimérica de anticuerpos suele ser de al menos 75%, preferentemente de al menos 80% y más preferentemente de al menos 85% según lo determinado por HPLC analítica donde el análisis se realiza preferentemente inmediatamente después del fraccionamiento por tamaño.

La pureza de la fracción monomérica de anticuerpos es generalmente de al menos 85%, preferentemente de al menos 90% y más preferentemente de al menos 95% según se determina por HPLC analítica, donde el análisis se realiza preferentemente inmediatamente después del fraccionamiento por tamaño. La fracción dimérica de anticuerpos se caracteriza preferentemente por una mayor reactividad a los exoantígenos como el toxoide tetánico y/o el virus respiratorio sincicial (VRS) y/o... [Seguir leyendo]

1. Un método para la fabricación de una composición farmacéutica que comprenda una fracción de anticuerpos humanos de una población heterogénea de donantes humanos, que consiste en:

(a) someter una preparación de anticuerpos humanos de una población heterogénea de donantes a un fraccionamiento por tamaño,

(b) recuperar la fracción de anticuerpos diméricos, y

(c) monomerizar los anticuerpos diméricos con un peso molecular aparente de aproximadamente 300 kDa.

2. El método de la reivindicación 1, donde el paso (a) comprende: separación de exclusión por tamaño, filtración en gel, ultrafiltración y otros métodos de separación en gel o membrana.

3. El método de la reivindicación 1, donde el paso (b) comprende ajustar a un pH ácido.

4. El método de la reivindicación 3, donde el pH ácido está en el rango de aproximadamente 3 a aproximadamente 5.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la preparación de anticuerpos humanos es una preparación de inmunoglobulinas policlonales. 20

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la fracción de anticuerpos humanos es una fracción de anticuerpos diméricos de una preparación intravenosa de inmunoglobulinas humanas policlonales (IGIV) .

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la pureza de los anticuerpos diméricos es de al menos 75%, preferentemente de al menos 80% y más preferentemente de al menos 85%.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el contenido de dímeros en el paso (c) es 10% o menos. 30

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual los anticuerpos del paso (c) tienen una actividad específica al menos dos veces mayor contra el toxoide tetánico o el virus respiratorio sincicial y contra la proteína de virulencia M de S. pyogenes o las células epiteliales Hep-2 respecto a la preparación de inmunoglobulinas no fraccionadas.

10. La composición farmacéutica obtenible por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para uso médico.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 destinada al tratamiento de infecciones, por ejemplo infecciones virales, bacterianas, fúngicas, protozoarias o parasitarias.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 destinada al tratamiento de infecciones agudas.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 destinada al uso en el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 destinada al uso en el tratamiento del síndrome de Sjögren. 50

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 destinada al uso en el mantenimiento o la restauración de la homeostasis autoinmunitaria.

Reactividad a la proteína M5 de S. pyogenes en fracciones de IGIV

Perfiles FACS de células COS-7 (HEP-G2, HEp-2, CHO)