Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1 (PD1) y métodos para el tratamiento del cáncer mediante el uso de anticuerpos anti-PD-1 solos o combinados con otros agentes inmunoterapéuticos.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo,

que comprende:

a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen lasecuencia mostrada en el SEC ID NO: 18;

b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen lasecuencia mostrada en el SEC ID NO: 25;

c) una CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuenciamostrada en el SEC ID NO: 32;

d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen lasecuencia mostrada en el SEC ID NO: 39;

e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen lasecuencia mostrada en el SEC ID NO: 46; y

f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen lasecuencia mostrada en el SEC ID NO: 53;

en donde el anticuerpo se une específicamente a la proteína Muerte Programada 1 (PD-1) humana.

Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1 (PD1) y métodos para el tratamiento del cáncer mediante el uso de anticuerpos anti-PD-1 solos o combinados con otros agentes inmunoterapéuticos

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia en el tratamiento de enfermedades humanas y la reducción de los eventos adversos relacionados con las mismas. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-PD-1 y al uso de los anticuerpos y de inmunoterapia combinada, incluyendo la 10 combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1, para tratar el cáncer y/o para disminuir la incidencia o la magnitud de los eventos adversos relacionados con el tratamiento con dichos anticuerpos individualmente.

Antecedentes de la invención La proteína Muerte Programada 1 (PD-1) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. La PD-1 se expresa en células B activadas, células T, y células mieloides (Agata et al, supra.; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al (2003) J Immunol 170:711-8) . Los miembros iniciales de la familia, CD28 e ICOS, fueron descubiertos por los efectos funcionales en el aumento de la proliferación de células T después de la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff et al. (1999) 20 Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) 10:247-260 Inmunogenics) . La PD-1 fue descubierta a través del escrutinio de la expresión diferencial en células apoptóticas (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887-95) . Los otros miembros de la familia, CTLA-4, y BTLA se descubrieron a través del escrutinio de la expresión diferencial en linfocitos T citotóxicos y células TH1, respectivamente. CD28, ICOS y CTLA-4 tienen un residuo de cisteína desapareado que permite la homodimerización. En contraste, se sugiere que PD-1 existe como un monómero, que 25 carece del residuo de cisteína no apareado característico en otros miembros de la familia CD28.

El gen de PD-1 es una proteína transmembrana de tipo I de 55 kDa que es parte de la superfamilia de genes de Ig (Agata et al. (1996) Int. Immunol 8:765-72) . La PD-1 contiene un inmunoreceptor con motivo inhibidor basado en tirosina proximal a la membrana (ITIM) y un motivo de activación "switch" basado en tirosina distal a la membrana 30 (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J. Exp. Med. 181:1953-6; Vivier, E y Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91) . Aunque estructuralmente similar a CTLA-4, PD-1 carece del motivo MYPPPY que es crítico para la unión de B7-1 y B7-2. Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan a la baja la activación de células T tras la unión a PD-1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat. Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:63443) . Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de 35 B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia CD28. Un ligando de PD-1, PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med 8:787-9) . La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por el receptor de células T, y la evasión inmunitaria de las células cancerosas (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) 40 Clin. Cancer Res. 10:5094-100) . La inmunosupresión puede ser revertida mediante la inhibición de la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 está también bloqueada (Iwai et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66) .

La PD-1 es un miembro de inhibidor de la familia CD28 expresado en células B activadas, células T, y células 45 mieloides (Agata et al, supra.; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8) . Los animales carentes de PD-1 desarrollan diversos fenotipos autoinmunes, incluyendo miocardiopatía autoinmune y un síndrome de tipo lupus con artritis y nefritis (Nishimura et al. (1999) Inmmunity 11:141-51; Nshimura et al. (2001) Science 291:319-22) . Además, se ha encontrado que PD-1 desempeña un papel en la encefalomielitis autoinmune, el lupus eritematoso generalizado, la enfermedad de injerto contra anfitrión 50 (EICA) , la diabetes de tipo I, y la artritis reumatoide (Salama et al. (2003) J. Exp. Med. 198:71-78; Prokunina y Alarcón-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13:R143 ; Nielsen et al. (2004) Lupus 13:510) . En una línea de tumor de células B murina, se ha demostrado que el ITSM de PD-1 es esencial para bloquear el flujo de Ca2+ mediado por BCR y la fosforilación de tirosina de las moléculas efectoras aguas abajo (Okazaki et al. (2001) PNAS 98:13866-71) .

En consecuencia, se desean agentes que reconozcan PD-1, y métodos de uso de tales agentes.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales 60 humanos, que se unen a PD-1 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, unión de alta afinidad a PD-1 humana, pero con carencia de reactividad cruzada sustancial con cualquiera de CD28, CTLA-4 o ICOS humanas. Aún más, se ha demostrado que los anticuerpos de la invención modulan la respuesta inmune. Los anticuerpos se utilizan para inhibir el crecimiento de las células tumorales in vivo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 18;

b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la 5 secuencia mostrada en el SEC ID NO: 25;

c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 32;

d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 39; 10

e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 46; y

f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 53;

en donde el anticuerpo se une específicamente a la proteína Muerte Programada 1 (PD-1) humana. El anticuerpo 15 puede comprender:

a) una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 4; y

b) una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 11; 20

en donde el anticuerpo se une específicamente a PD-1 humana.

Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano, aunque en realizaciones alternativas el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

En realizaciones más preferidas, el anticuerpo se une a PD-1 humana con una KD de 5 x 10-8 M o menos, se une a PD-1 humana con una KD de 1 x 10-8M o menos, se une a PD-1 humana con una KD de 5 x 10-9 M o menos, o se une a PD-1 humana con una KD de entre 1 x10-8 M y 1 x 10-10 M.

La invención también proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, en 30 donde el anticuerpo compite de manera cruzada por la unión a PD-1 con, como anticuerpo de referencia, un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención.

Preferiblemente, un anticuerpo de la invención a) se une a PD-1 humana con una KD de 5 x 10-9 o menos, y b) no se une ni ICOS humana, ni a CTLA-4 humana ni a CD28 humana. Típicamente, el anticuerpo se une a PD-1 humana 35 expresada en una superficie celular.

Preferiblemente, el anticuerpo inhibe la supresión de las células CD25-T CD4+ por las células T reguladoras. El anticuerpo puede mejorar la respuesta de memoria específica de antígeno a un tumor o un patógeno o puede conferir una inmunidad persistente a la recaída del tumor. El anticuerpo puede tener un isotipo IgG4, que 40 opcionalmente no tiene ni actividad ADCC ni actividad CDC.

Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos completos, por ejemplo de un isotipo IgG1 o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab o Fab'2, o anticuerpos de cadena sencilla. 45

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 18;

b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la 5 secuencia mostrada en el SEC ID NO: 25;

c) una CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 32;

d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 39; 10

e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 46; y

f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 53;

en donde el anticuerpo se une específicamente a la proteína Muerte Programada 1 (PD-1) humana. 15

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende:

a) una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 4; y

b) una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada 20 en el SEC ID NO: 11;

en donde el anticuerpo se une específicamente a PD-1 humana.

3. Un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo compite de forma cruzada por la unión a PD-1, con el anticuerpo de la reivindicación 1 o 2. 25

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo a) se une a PD-1 humana con una KD de 5x10-9 o menos; y

b) no se une ni a ICOS humano, ni a CTLA-4 humano ni a CD28 humano.

5. El anticuerpo monoclonal o porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se une a PD-1 humana expresada en una superficie celular.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo inhibe la supresión de las células T CD4+ CD25 por las células T reguladoras. 35

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo potencia la respuesta de memoria específica de antígeno a un tumor o un patógeno.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo confiere una inmunidad 40 persistente a la recaída del tumor.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es un isotipo IgG4.

10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo no tiene actividad ADCC ni actividad CDC. 45

11. Una composición que comprende el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 50 para su uso en un método para modular una respuesta inmunitaria.

13. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para sui uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales.

14. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 13, en donde las células tumorales son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón.

15. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 13, en donde las células 60 tumorales son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores 5 sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC) , linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor de eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos ambientalmente, incluyendo los inducidos por el amianto, y combinaciones de dichos cánceres. 10

16. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa.

17. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 16, en donde la enfermedad 15 infecciosa es causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en VIH, Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Hepatitis A, B, o C, un virus del herpes, VZV, HSV-1, 6-HAV, HSV-II, CMV, virus de Epstein Barr, adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus de coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, el virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, el virus JC, virus de la 20 encefalitis por arbovirus, clamidia, bacterias Rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis, bacteria de la enfermedad Lyme, Candida albicans, krusei, glabrata o tropicalis, Cr y ptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus o niger, Mucorales mucor, absidia o rhizophus, Sporothrix schenckii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides 25 immitis, Histoplasma capsulatum, Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lamblia, Cr y ptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Tr y panosoma brucei, Tr y panosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma Gondi y Nippostrongylus brasiliensis.

18. Un producto inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una 30 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, conectados a un agente terapéutico.

19. Una composición que comprende el producto inmunoconjugado de la reivindicación 18 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. El producto inmunoconjugado de la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico es una citotoxina.

21. Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 20 y un portador farmacéuticamente aceptable.

22. El producto inmunoconjugado de la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico es un isótopo radiactivo.

23. Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, conectados a un segundo radical funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo.

25. Una composición que comprende la molécula biespecífica de la reivindicación 24, y un portador 50 farmacéuticamente aceptable.

Unión de AbHuMab anti-hPD-1 a células T humanas activadas

Concentración [nM]

Figura.15a

Unión de AbHuMab anti-hPD-1 a celulas PBMC de mono Cynomolgus activadas

Concentración [nM]

Figura 15b