Anticuerpos específicos para el complejo de interleucina 6 y el receptor de interleucina 6.

Un anticuerpo aislado, que se une al complejo IL-6 : IL-6Ra formado por la IL-6 y el IL-6Ra,

y que no se une ni aIL-6 ni a IL- 6Ra solos y que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, en el que el anticuerpo comprende undominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo comprende unconjunto de CDR, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y eldominio VL comprende LCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR seselecciona del grupo que consiste en:

a. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 , HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 4, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 8, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10;

b. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 14, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 18, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20;

c. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 24, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 28, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30;

d. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 34, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 38, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40; y

e. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 44, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 48, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50.

Anticuerpos específicos para el complejo de interleucina 6 y el receptor de interleucina 6

Esta invención divulga miembros de unión, especialmente moléculas de anticuerpo, que inhiben los efectos biológicos de la IL-6. Los miembros de unión son útiles para el tratamiento de trastornos asociados con la IL-6, incluyendo enfermedades inflamatorias y tumores.

La interleucina 6 (IL-6) es una citocina proinflamatoria pleiotrópica de 26 kDa producida por una variedad de tipos de células, incluyendo fibroblastos estimulados, monocitos y células endoteliales, que constituyen la fuente principal de IL-6 in vivo. Células tales como los linfocitos T, los linfocitos B, los macrófagos, los queratinocitos, los osteoblastos y varias otras pueden producir IL-6 con estimulación. La IL-6 también se expresa por líneas de células tumorales y células tumorales, por ejemplo, células de carcinoma de pulmón, cáncer de próstata, mieloma, hipernefroma y mixoma cardíaco (Kishimoto, T., Blood 74:1-10 (1989) y Smith P.C. et al. Cytokine and Growth factor Reviews 12:33

40 (2001) ) . En condiciones no inflamatorias, se secreta IL-6 desde el tejido adiposo (Wallenius et al., Nat. Med. 8:75 (2002) ) .

La regulación de la expresión de la IL-6 depende del tipo de célula que la produce. En células de mieloma múltiple parece que la IL-6 actúa en un bucle de retroalimentación positiva, que estimula el crecimiento de las células y la producción de más IL-6 (Kawano et al. Nature 332:83 (1988) y Van Zaanen et al. J. Clin Invest. 98:1441-1448 (1996) ) . En otros tipos de células, parece que la IL-6 inhibe el crecimiento y la activación de las células y puede actuar como regulador negativo para algunas citocinas proinflamatorias.

Para iniciar la señalización celular, la IL-6 se une con baja afinidad a un receptor transmembranario, el receptor de IL-6 alfa (denominado también IL-6Ra, IL-6Ra, IL-6R, gp80 o CD126) para formar un complejo "IL-6:IL-6Ra". Este complejo se une al receptor de señales gp130; IL-6Ra y gp130 forman conjuntamente un sitio de unión de IL-6 de alta afinidad e inducen la formación de un hexámero compuesto por dos copias de cada uno de IL-6, IL-6Ra y gp130 (Somers, W., et al. 1997. 1.9 EMBO J. 16:989-997) . Los dominios transmembranario y citoplásmico del IL-6Ra no son necesarios para la transducción de señales, ya que el IL-6Ra existe también en forma secretada soluble (sIL-6R

o sIL-6Ra) . El receptor soluble se produce por ayuste diferencial del mensajero de IL-6Ra o por liberación proteolítica. El sIL-6R puede formar un complejo ligando-receptor con la IL-6, "IL-6:sIL-6Ra". Este complejo se puede unir a gp130 de las células y, de este modo, iniciar la señalización celular en células positivas para gp130, incluso si esas células no expresan el IL-6Ra. Así, el sIL-6R tiene el potencial de ampliar el repertorio de células que responden a la IL-6 y se cree que desempeñan un papel importante en la inflamación mediada por IL-6 (Jones, S. A

et al. 2001. FASEB J. 15:43-58) .

Se ha dilucidado la estructura cristalina del ligando de IL-6 humana (Somers et al. EMBO J. (1997) 16:989-997) . También se han resuelto la estructura cristalina del dominio extracelular del IL-6Ra humano (Varghese et al. Proc Nat Acad Sci (2002) 99:15959-15964) y la estructura hexamérica del complejo IL-6/IL-6R/gp130 (Boulanger et al. 40 Science 300:2101-2104 (2003) ) . Estas estructuras combinadas con estudios de mutagénesis han identificado tres sitios sobre la superficie de la IL-6 que están implicados en la actividad funcional de la IL-6 en complejo con los diversos componentes del receptor. Los residuos del sitio 1 están implicados en la interacción entre la IL-6 y el IL6Ra. Los residuos del sitio 2 están implicados en la interacción entre la IL-6 y el dominio de unión a citocinas de gp130. Los residuos del sitio 3 de la IL-6 están implicados en la interacción con el dominio de tipo Ig del segundo 45 gp130 del complejo hexamérico. También se ha identificado un cuarto sitio en IL-6 donde la IL-6 interacciona con la segunda molécula de IL-6 del complejo hexamérico IL-6/IL-6R/gp130 (Menziani et al. (1997) Proteins: Structure Function and Genetics 29, 528) .

Se han llevado a cabo estudios similares en el dominio extracelular del IL-6Ra humano. Esta región extracelular

tiene 3 dominios D1 (P26-V112) , D2 (P113-Q215) , D3 (P216-M311) . Aunque se ha demostrado que el dominio Ig D1 no es imprescindible para el reconocimiento del ligando y la inhibición de la señal, está implicado en la internalización del receptor y la estabilidad de la proteína. Los dominios D2 y D3 son dominios de fibronectina de tipo III y forman el dominio de unión a citocinas. En estudios estructurales se han identificado tres sitios "de agrupación" en este dominio extracelular (Varghese et al. Proc Nat Acad Sci (2002) 99:15959-15964) ; Los residuos de la 55 agrupación 1 están implicados de forma predominante en la unión al ligando IL-6. Los residuos de la agrupación 2 forman parte de la interfaz de dimerización del IL-6Ra. Estos residuos interfieren con la formación del dímero de IL6R y tienen un efecto significativo sobre la señalización de IL-6, pero no en la unión de IL-6. Los residuos de la agrupación 3 del IL-6Ra están implicados en la formación del complejo IL-6/IL6R con gp130 para formar el complejo hexamérico IL-6/IL-6Ra/gp130.

Se han aislado una serie de anticuerpos monoclonales anti-ligando IL-6. Se han realizado estudios de mapeo que demuestran que éstos se unen a diferentes sitios de unión, como se describe anteriormente, sobre la superficie de la IL-6 humana (Brakenhoff et al. J. Immunol. (1990) 145:561-568, Wijdenes et al. Mol Immunol. (1991) 28:1183-1191, Brakenhoff et al. (1994) JBC 269:86, Kalai et al. (1996) Eur J Biochem 238 714-723, Kalai et al. (1997) Blood

89:1319-1333) .

También se han generado una serie de anticuerpos monoclonales anti-IL-6Ra y se han mapeado sus sitios de unión en el IL-6Ra (Hirata et al. (1989) J. Immunol 143:2900-2906, Kalai et al. (1996) Eur J Biochem 238 714-723, Kalai et al. (1997) Blood 89:1319-1333, Kalai et al. (1997) Eur J. Biochem 249:690-700) .

La IL-6 pertenece a una familia de citocinas que incluye la interleucina 11 (IL-11) , el factor neurotrófico ciliar (CNTF) , la oncostatina M (OsM) , el factor inhibidor de la leucemia (LIF) , la citocina similar a la cardiotrofina (CLC) y la cardiotrofina 1 (CT-1) . Cada uno de los miembros de esta familia tiene sus propias subunidades de receptor alfa específicas y forma complejos con la subunidad de receptor común gp130. La alteración dirigida del gen de gp130 es mortal para los embriones (Ernst, M. y B. J. Jenkins. 2004. Trends Genet. 20:23-32 y Yoshida, K. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:407-411) . Todos los miembros de la familia de la IL-6 pueden inducir la expresión de proteínas de fase aguda a partir de hepatocitos.

La señalización de IL-6 implica la fosforilación de tirosinas por cinasas de la familia JAK y la posterior activación de dos cascadas de señalización intracelular principales, las rutas SHP2/ERK MAPK y STAT1/3, que dan lugar a la 15 expresión génica a través de NF-IL-6 y AP-1 (Ernst, M. y B. J. Jenkins. 2004. Trends Genet. 20:23-32, y Heinrich, P.

C. et al. 2003. Biochem.J. 374:1-20) .

La IL-6 muestra un amplio espectro de funciones biológicas, incluyendo la hematopoyesis, la inducción de respuestas de fase aguda, la activación de linfocitos T, la estimulación de la secreción de anticuerpos, la defensa del huésped contra la infección, la activación de células de mieloma y de osteoclastos (Choy, E. 2004. Rheum.Dis.Clin.North Am. 30:405-415 y Jones SA et al. FASEB J 15:43-58 (2001) ) . Para una revisión de los efectos de la IL-6, véase Kishimoto Arthritis Research & Therapy 2006 8: Supl. 2/S2. Originalmente, se identificó la IL-6 como un factor de diferenciación de linfocitos B generado por linfocitos T (Hirano T et al. Nature (1986) 324:73-76) , pero posteriormente se ha identificado como un potente factor activador y promotor del crecimiento de muchos tipos 25 de células. Induce la maduración final de los linfocitos B a células productoras de anticuerpos y es un factor accesorio esencial para la activación y proliferación de los linfocitos T. Se ha demostrado en estudios que la IL-6 está implicada en la activación de linfocitos T autorreactivos y la proliferación y diferenciación de linfocitos T citotóxicos. Se ha implicado la IL-6 en la hematopoyesis como un cofactor que provoca la activación y la diferenciación de células madre hematopoyéticas. El efecto de la IL-6 sobre la respuesta de fase aguda también está bien documentado (para una revisión, véase Moshage J Pathol. (1997) 181:257-266)... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado, que se une al complejo IL-6 : IL-6Ra formado por la IL-6 y el IL-6Ra, y que no se une ni a IL-6 ni a IL- 6Ra solos y que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, en el que el anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo comprende un conjunto de CDR, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR se selecciona del grupo que consiste en:

a. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 , HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10;

b. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20;

c. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30;

d. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40; y

e. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50.

2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de anticuerpo comprende:

un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7; o un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17; o un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27; o un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37; o un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47.

3. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130 y tiene una CI50 de no más de 700 nM en un ensayo de fluorescencia de resolución temporal homogénea para la inhibición de la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, con una concentración final de 1 nM de complejo de y 1 nM de gp130.

4. Una composición que comprende un anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal por intervención quirúrgica o tratamiento.

5. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la IL-6 en un individuo, en el que el trastorno asociado con la IL-6 se selecciona de entre: una enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria, un tumor y/o un cáncer, un trastorno linfoproliferativo, rechazo de aloinjerto, caquexia, osteoporosis, traumatismo cerebral, edema cerebral, depresión, insuficiencia cardíaca congestiva o dolor óseo.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo,

de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Una célula huésped transformada in vitro con ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un método de producción de un anticuerpo, que comprende cultivar células huésped de acuerdo con la reivindicación 7 en condiciones para la producción del anticuerpo.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además aislar y/o purificar el anticuerpo.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende además formular el anticuerpo en una composición que comprende al menos un componente adicional.