Anticuerpo específico para EPHB3 y usos del mismo.

Un anticuerpo monoclonal que (a) se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M omenos,

(b)

(i) compite con el anticuerpo XPA.04.001, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(ii) compite con el anticuerpo XPA.04.013, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 5 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 6 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iii) compite con el anticuerpo XPA.04.018, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 7 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 8 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iv) compite con el anticuerpo XPA.04.048, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC IDNº: 9 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 10 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(v) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.001 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3)de SEC ID Nº: 3 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 4),

(vi) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.013 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102(CDR3) de SEC ID Nº: 5 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-103 (CDR3) de SEC ID Nº: 6),

(vii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.018 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102(CDR3) de SEC ID Nº: 7 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 8), o

(viii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.048 (residuos 24-39 (CDR1), 55-61 (CDR2) y 94-102(CDR3) de SEC ID Nº: 9 y los residuos 26-35 (CDR1), 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 10),

y (c) induce la fosforilación de EphB3 y/o degradación de EphB3.

La presente invención se refiere a procedimientos para prevenir y tratar cáncer administrando anticuerpos específicos para EphB3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aunque “cáncer” se usa para describir muchos tipos diferentes de cáncer, es decir, mama, próstata, pulmón, colon, páncreas, cada tipo de cáncer se diferencia tanto al nivel fenotípico como al nivel genético. La característica de crecimiento no regulada del cáncer se produce cuando la expresión de uno o más genes se desregula debido a mutaciones o cambios epigenéticos, y ya no puede controlarse el crecimiento celular.

Los genes de control del crecimiento se clasifican frecuentemente en dos clases, oncogenes y genes supresores de tumores. Los oncogenes son genes cuya función normal es promover el crecimiento celular, pero solo bajo condiciones específicas. Cuando un oncogén adquiere una mutación y pierde ese control de la especificidad, promueve el crecimiento bajo una variedad mucho más amplia de condiciones. Sin embargo, se ha encontrado que para el cáncer es realmente satisfactorio que la célula cancerosa deba también adquirir mutaciones en genes supresores de tumor. La función normal de genes supresores de tumor es detener el crecimiento celular. Ejemplos de supresores de tumores incluyen p53, p16, p21 y APC, todos los cuales, cuando actúan normalmente, detienen que una célula se divida y crezca incontroladamente. Cuando un supresor de tumor se muta o pierde, ese freno del crecimiento celular también se pierde, permitiendo ahora que las células crezcan sin las restricciones normales.

EphB3 es un receptor en la familia de tirosina cinasa de receptores de efrina. Actualmente hay 14 receptores de Eph y 9 ligandos de efrina conocidos en seres humanos. Los receptores de efrina (Eph) y sus ligandos, las efrinas, median en numerosos procesos de desarrollo, particularmente en el sistema nervioso y sistemas vasculares. Las efrinas también son conocidas por desempeñar una función en el desarrollo tumoral, angiogénesis, crecimiento metastásico y supervivencia celular. Basándose en sus estructuras y relaciones de secuencia, las efrinas se dividen en la clase de efrina-A (EFNA) , que están ancladas a la membrana por un enlace glucosilfosfatidilinositol, y la clase de efrina-B (EFNB) , que son proteínas transmembrana. La familia de Eph de receptores se divide en 2 grupos basándose en la similitud de sus secuencias de dominio extracelular y sus afinidades para unirse a ligando de efrina-A y efrina-B. Los receptores de Eph constituyen el mayor subgrupo de la familia de tirosina cinasa de receptor (RTK) .

VAN HEVMEN y col., 2000, Binchi y col. y el documento WO 03/087841 desvelan todos anticuerpos que se unen a efrina B3.

Los receptores de Eph participan en cáncer. Las células NIH3T3 transfectadas con EphA1 y trasplantadas en ratones sin pelo producen tumores de 10 mm3 en 5-6 semanas, mientras que los controles de vector no produjeron ningún tumor durante el mismo periodo de tiempo (Maru y col., Oncogene. 1990 Mar; 5 (3) :445-7) . EphB2 se expresa a mayores niveles en cánceres de estómago (12/16) , colon (3/11) , esófago (3/6) , ovario (1/7) , riñón (1/2) y pulmón (1/1) cuando se compara con tejidos normales (Kiyokawa y col., Cancer Res 1994 Jul 15; 54 (14) :3645-50) . La expresión de EphB6 se correlaciona con neuroblastomas de bajo grado. El dominio de cinasa de EphB6 no es activo, por tanto, se ha propuesto que este receptor actúa de negativo dominante que se produce naturalmente (Tang y col., Clin Cancer Res 1999a Jun;5 (6) :1491-6) .

Hay un volumen creciente de pruebas que implican la participación de Eph y efrinas en angiogénesis. Se ha informado que la efrina A1, efrina B1, efrina B2, EphB2, EphB3 y EphB4 se expresan en vasos sanguíneos. La efrina A1 puede inducir angiogénesis en el modelo de córnea de rata y los anticuerpos para efrina A1 pueden inhibir angiogénesis inducida por TNF-α en este mismo modelo (Pandey y col., Science 1995 Apr 28; 268 (5210) :567-9) . La efrina B1 agrupada induce la unión a célula y el ensamblaje similar a capilar en P 19, una línea celular murina derivada de teratocarcinoma, y en células endoteliales microvasculares renales humanas (HRMEC) (Stein y col., Genes Dev 1998 Mar 1; 12 (5) :667-78) . La efrina B1 agrupada y la efrina B2 también pueden inducir la germinación de células endoteliales microvasculares derivadas de la corteza suprarrenal (ACE) (Adams y col., Genes Dev 1999 Feb 1; 13 (3) :295-306) . La inyección de un ARN de receptor EphB4 negativo dominante en embriones de Xenopus produce venas intersomáticas que se proyectan anormalmente en somitas adyacentes (Helbling y col., Development 2000 Jan;127 (2) :269-78) . Ratones inactivados doblemente en EphB2/EphB3, inactivados en EphB4 y efrina B2 tienen todos defectos de remodelación vascular (Adams y col., 1999; Wang y col., Cell 1998 May 29; 93 (5) :741-53;PCT documento WO 00/30673) .

Batlle y col., 2005, desvelan modelos inactivados en Eph

Las Eph también pueden desempeñar una función en metástasis. Células de riñón epiteliales humanas 293T transfectadas con tanto EphB3 como EphB2 presentan adhesión de células reducida a superficies recubiertas de fibronectina o colágeno in vitro. El fracaso de células 293 a adherirse se medió por la fosforilación de EphB2 de R

ras, seguido de desactivación de integrinas (Zou y col., Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Nov 23; 96 (24) :13813-8) .

Las Eph parecen funcionar por señalización tras la activación. La unión de efrina induce la oligomerización de receptores de Eph causando la fosforilación de residuos de yuxtamembrana de Eph. Las Eph activadas tienen múltiples tirosinas fosforiladas que actúan de sitios de unión para las proteínas de señalización (por ejemplo, proteínas que contienen RasGAP, Src, LMW-PTP, PLCg, PI3-cinasa, Grb2 y PDZ) .

La expresión en exceso de receptores de Eph (EphA1, EphA2, EphB2) produce la transformación en ausencia de hiperfosforilación de receptores. Los receptores EphB fosforilados regulan negativamente la ruta de Ras-MAP-cinasa y la señalización de FAK, alterando el crecimiento celular.

EphB3 (también conocido como Hek2, Sek4, Mdk5, Tyro6, Cek10 y Qek10) es un receptor para los miembros de la familia de efrina B (efrina B1, efrina B2 y efrina B3) , y se sabe que se expresa en tejido normal y en ciertos tumores y líneas de células cancerosas. Hasta la fecha, sin embargo, la función de EphB3 en cáncer no se había elucidado. Así, hay una necesidad de identificar composiciones y procedimientos que modulen EphB3 y su función en tales cánceres.

Bohme y col., 1996, documentos EP 1400807, WO2004/005457 y WO2006/047639, desvelan anticuerpos que se unen a receptores de Eph. La presente invención se refiere a estas, además de a otras, necesidades importantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal que (a) se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos, (b)

(i) compite con el anticuerpo XPA.04.001, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(ii) compite con el anticuerpo XPA.04.013, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 5 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 6 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iii) compite con el anticuerpo XPA.04.018, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 7 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 8 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iv) compite con el anticuerpo XPA.04.048, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 9 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 10 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(v) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.001 (residuos 24-39 (CDR1) , 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 3 y los residuos 26-35 (CDR1) , 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 4) ,

(vi) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.013 (residuos 24-39 (CDR1) , 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 5 y los residuos 26-35 (CDR1) , 50-66 (CDR2) y 99-103 (CDR3) de SEC ID Nº: 6) ,

(vii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.018 (residuos 24-39 (CDR1) , 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 7 y los residuos 26-35 (CDR1) , 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 8) , o (viii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.048 (residuos 24-39 (CDR1) , 55-61 (CDR2) y 94-102 (CDR3) de SEC ID Nº: 9 y los residuos 26-35 (CDR1) , 50-66 (CDR2) y 99-102 (CDR3) de SEC ID... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que (a) se une al dominio extracelular de EphB3 con una afinidad (KD) de 10-6 M o menos, (b)

(i) compite con el anticuerpo XPA.04.001, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 3 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 4 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(ii) compite con el anticuerpo XPA.04.013, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 5 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 6 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iii) compite con el anticuerpo XPA.04.018, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 7 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 8 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(iv) compite con el anticuerpo XPA.04.048, que comprende una región variable de la cadena ligera de SEC ID Nº: 9 y una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº: 10 para unirse a EphB3 más del 75 %,

(v) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.001 (residuo.

2. 39 (CDR1) .

5. 61 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 3 y los residuo.

2. 35 (CDR1) .

5. 66 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 4) ,

(vi) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.013 (residuo.

2. 39 (CDR1) .

5. 61 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 5 y los residuo.

2. 35 (CDR1) .

5. 66 (CDR2) .

9. 103 (CDR3) de SEC ID Nº: 6) ,

(vii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.018 (residuo.

2. 39 (CDR1) .

5. 61 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 7 y los residuo.

2. 35 (CDR1) .

5. 66 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 8) , o (viii) comprende las 6 CDR de anticuerpo XPA.04.048 (residuo.

2. 39 (CDR1) .

5. 61 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 9 y los residuo.

2. 35 (CDR1) .

5. 66 (CDR2) .

9. 102 (CDR3) de SEC ID Nº: 10) ,

y (c) induce la fosforilación de EphB3 y/o degradación de EphB3.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se une al mismo epítope de EphB3 que cualquiera de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo Human Engineered, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un fragmento de anticuerpo.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una región constante de una secuencia de anticuerpo humano y una o más regiones estructurales variables de la cadena pesada y ligera de una secuencia de anticuerpo humano.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la secuencia de anticuerpo humano es una secuencia humana individual, una secuencia consenso humana, un secuencia humana individual de la línea germinal, o una secuencia consenso humana de la línea germinal.

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región constante de la cadena pesada es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada o sin modificar, un fragmento de la misma, o combinaciones de las mismas.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una afinidad de unión de 10-7, 10-8 ó 10 9 M o menos por EphB3.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que inhibe (i) la unión de una efrina B a EphB3; y/o (ii) la proliferación de una célula cancerosa, tal como una célula de cáncer de pulmón, ovario, esófago, colon o mama.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está conjugado con otro agente de diagnóstico o terapéutico.

10. Un procedimiento de seleccionar un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de EphB3 con un anticuerpo candidato que contiene 6 CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048; detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato al polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una afinidad de unión de al menos 10-6 M.

11. Un procedimiento de alterar sistemáticamente anticuerpos y seleccionar un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

preparar un anticuerpo candidato que contiene modificaciones a uno o dos aminoácidos dentro de las CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048, poner en contacto un polipéptido que comprende el DEC de EphB3 con dicho anticuerpo candidato detectar la afinidad de unión del anticuerpo candidato al polipéptido, e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una afinidad de unión de al menos 10-6 M.

12. Un procedimiento de selección de un anticuerpo para el dominio extracelular de una proteína EphB3 útil para el tratamiento de cáncer que comprende las etapas de:

poner en contacto una célula de pulmón, ovario, esófago, colon o mama con un anticuerpo candidato que contiene 6 CDR de los anticuerpos XPA.04.001, XPA.04.013, XPA.04.018 o XPA.04.048 o un anticuerpo que contiene una modificación de uno o dos aminoácidos dentro de una o más CDR; detectar la proliferación o supervivencia de dicha célula; e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo útil para el tratamiento de cáncer si se detecta una disminución en la proliferación o supervivencia celular.

13. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1- 9.

14. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 operativamente ligada a una secuencia de control reguladora.

15. Una célula huésped que expresa un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y comprende el vector de la reivindicación 14 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13.

16. Un procedimiento de uso de la célula huésped de la reivindicación 15 para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 15 bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo.

17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que se purifica a al menos el 95 % de homogeneidad en peso.

18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un kit que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo, envasada en un recipiente, conteniendo dicho kit opcionalmente un segundo agente terapéutico, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el recipiente, etiqueta que describe el contenido del recipiente y que proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso del contenido del recipiente para tratar cáncer, por ejemplo, en el que el recipiente es un vial o frasco o jeringuilla precargada.