Vacuna contra la fiebre aftosa, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de antígeno queconsiste en cápsidas vacías del virus aftoso,

obtenidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas,del ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la regióndel genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, comprendiendo la vacuna además unvehículo o excipiente farmacéutica mente aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNcde la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para elaminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38, o del codón que codifica para elaminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38 por uncodón que codifica para una cisteína.

Vacuna contra la fiebre aftosa

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a vacunas contra la fiebre aftosa y en particular a la mejora de su estabilidad térmica. También se refiere a procedimientos de preparación de esas vacunas, al uso de antígenos para la realización de esas vacunas y a los métodos de vacunación que las usan.

También se refiere concretamente a secuencias de nucleótidos, en particular ADNc, y a secuencias de aminoácidos, modificadas con respecto a las secuencias naturales del virus. Y la invención se refiere a los productos de expresión de las secuencias de nucleótidos modificadas y a los antígenos y a los virus aftosos que incorporan estas modificaciones.

Estado de la técnica

La fiebre aftosa es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a los animales de producción. Esta enfermedad es endémica en numerosos países en el mundo, concretamente en África, en Asia y en Sudamérica. Además, aparecen focos endémicos de manera episódica.

La presencia de esta enfermedad en un pais puede tener consecuencias económicas muy graves por las pérdidas de productividad, pérdidas de peso y de leche en las ganaderías afectadas y por los embargos comerciales impuestos a ese país.

Las medidas contra esta enfermedad consisten en la aplicación estricta de medidas de restricción de importación, de controles sanitarios y de cuarentenas, en el sacrificio de los animales enfermos y en programas de vacunación con ayuda de vacunas inactivadas, o bien preventivas a nivel nacional o regional, o bien perifocal en caso de aparición de un foco epidémico.

La enfermedad se caracteriza por su corto periodo de incubación, su naturaleza muy contagiosa, la formación de aftas en la boca y en las patas, y algunas veces por la mortalidad en animales jóvenes. La fiebre aftosa afecta a varias especies animales, en particular los animales bovinos, porcinos, ovinos y caprinos.

El agente responsable de esta enfermedad es un virus de ácido ribonucleico (ARN) perteneciente al género de los aftovirus y a la familia de los Picomaviridae (eooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180) . El virus de la fiebre aftosa también se denomina con las siglas en inglés FMDV ("foot-and-mouth disease virus", virus de la glosopeda) . Actualmente, se conocen 7 tipos del virus de la fiebre aftosa, los tipos europeos (A, O Y e) , los tipos africanos (SAT1, SAT2 YSAT3) y un tipo asiático (Asia 1) . También se distinguen numerosos subtipos (Kleid et al. en Science, 1981, 214, 1125-1129) .

Se trata de un virus desnudo de forma icosaédrica de aproximadamente 25 nm de diámetro que encierra una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de aproximadamente 8500 nucleótidos. Esta molécula de ARN está compuesta por un único marco de lectura abierto (ORF) que codifica · para una única poliproteína que encierra entre otras cosas el precursor de la cápsida también denominada proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino-terminal.

Durante el proceso de maduración, la proteina P1 se escinde por la proteasa 3e en tres proteínas denominadas VPO, VP1 y VP3 (o respectivamente 1AB, 1 D Y 1e) (Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261) . En el virión, la proteína VPO se escinde a continuación en dos proteínas, VP4 y VP2 (o respectivamente 1A y 1 B) . Se desconoce el mecanismo de conversión de las proteínas VPO en VP1 y VP3 y de formación de viriones maduros.

Las proteínas VP1, VP2 YVP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, la proteína VP4 es más pequeña, con aproximadamente 8.000 Da.

La asociación simple de las proteínas de cápsida forma el protómero o la molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápsida del virus aftoso. Este protómero se compleja a continuación para dar un pentámero para formar la molécula 12S.

El virión resulta de la encapsidación de una molécula de ARN genómico por medio del ensamblaje de 12 pentámeros 12S, constituyendo así las partículas 146S.

La cápsida viral también puede formarse sin la presencia en el interior de la misma de una molécula de ARN . La cápsida está entonces vacia. A la cápsida vacia también se le denomina particula 70S. La formación de cápsidas vacías puede producirse de manera natural durante la replicación viral o provocarse artificialmente mediante tratamiento químico.

Para ser eficaz, una vacuna contra la fiebre aftosa debe ser en general polivalente. Su composición debe renovarse en cuanto cambian el o los tipos dominantes en el terreno. Por otro lado, para bloquear el rápido desarrollo de la enfermedad en el seno del ganado, conviene tener una vacuna que induzca una inmunidad temprana y que sea fuertemente protectora.

Se han planteado numerosas hipótesis, vías de investigación, propuestas para intentar desarrollar vacunas eficaces contra la fiebre aftosa. Actualmente, las únicas vacunas comercializadas son vacunas de virus inactivados.

El tratamiento químico de inactivación puede conllevar una disminución del poder inmunogénico del virus y de la producción de anticuerpos neutralizantes. Las dosis administradas con frecuencia deben ir acompañadas por adyuvantes para estimular la respuesta inmunitaria, pero según sus composiciones estos adyuvantes también pueden inducir reacciones inflamatorias. Las vacunas inactivadas no confieren inmunidad durante un largo periodo, por tanto hay necesidad de practicar inyecciones de refuerzo todos los años, incluso más en caso de dificultades, concretamente durante apariciones de focos epidémicos.

Además, existen riesgos asociados con una inactivación incompleta y/o el escape de virus durante la producción de vacunas inactivadas (por ejemplo King et al. , 1981, Nature, 293, 479-480) .

El desarrollo de las técnicas de ingeniería genética deberia haber permitido considerar la producción de vacunas subunitarias y de vectores recombinados. Sin embargo, a pesar de numerosos intentos, ninguno de ellos se comercializa actualmente.

Previamente a estos trabajos, se han realizado estudios sobre las cápsidas vacías naturales. Concretamente Rowlands et al. (Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238) muestran que los viriones de la fiebre aftosa A10 comprenden principalmente las cuatro proteínas VP1, VP2, VP3 Y VP4. En comparación, las cápsidas vacías naturales (no obtenidas mediante recombinación sino purificadas a partir de cultivos de virus aftoso A 10) contienen esencialmente la proteína VPO no escindida, se describen resultados idénticos con el virus aftoso A-Pando por Rweyemamu (Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79) . Las cápsidas vacías artificiales, obtenidas tras diálisis en presencia de Tris-EDTA y tras centrifugación, no contienen ninguna proteína VP4. Estas cápsidas artificiales son, según Rowlands et al., poco inmunogénicas y las cápsidas vacías naturales sólo son inmunogénicas tras tratamiento mediante formaldehído para estabilizarlas, sin embargo la respuesta de anticuerpos inducida por las cápsidas vacías naturales en cobayas no es constante como indica el autor. Además, Rowtands et al. y Rweyemamu et al. no están de acuerdo en cuanto a la necesidad de estabilidad las cápsidas vacías naturales. Para Rweyemamu et al., la ausencia de tratamiento mediante formaldehído no es perjudicial para el nivel de antigenicidad de las cápsidas vacías naturales. La inmunogenicidad sólo se somete a prueba mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes en cobayas.

Algunos autores no siguen esta corriente de pensamiento en cuanto a las cápsidas vacías, incluso se oponen a la misma. Es el caso de Doel T. R. Y Chong W. K. T. (Doel et al., Archives of Virology, 1982, 73, 185-191) que concluyen a partir de sus resultados de experimentos que las cápsidas vacías son menos inmunogénicas ya que son menos estables que los viriones aftosos de subtipo A24.

Se compara la expresión del gen que codifica para el precursor P1 de las proteínas de cápsidas por un baculovirus recombinado en células de insectos con la expresión del gen que codifica para P1 asociado a la proteasa 3C en E. coli (Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829; Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572~580) . La coexpresión de P1 y 3C en E. coli da como resultado el ensamblaje de cápsidas vacías 70S. El producto de expresión... [Seguir leyendo]

1. Vacuna contra la fiebre aftosa, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de antígeno que consiste en cápsidas vacías del virus aftoso, obtenidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas, del ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, comprendiendo la vacuna además un vehículo o excipiente farmacéutica mente aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 38 por un codón que codifica para una cisteína.

2. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 1, caracterizada porque el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido X6 de la secuencia X1 Gly X3 X4 Gly X6 Leu Xa X9 Ser X11 X12 Tyr Met en la que

- X4y X11 son Tyr, His o Phe, -X3, Xe y X12 son Val, Met, lIe, Thr o Ala, -X6 es His, Gln, Arg, Lys, Ser o Gly, -X1 es His o Lys -X9 es Asp, Glu o Lys; por un codón que codifica para una cisteína.

3. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque las cápsidas vacías del virus aftoso comprenden las proteínas VPO, VP1 y VP3.

4. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el ADNc que codifica para P1 también codifica para la totalidad o una parte de 2A.

5. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 4, caracterizada porque el ADNc también codifica para una parte de 28.

6. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el ADNc que codifica para 3C también codifica para la totalidad o una parte de las proteínas 38, para una parte no funcional de 3D, o a la vez para la totalidad o una parte de las proteínas 38 y para una parte no funcional de 3D.

7. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivil1dicaciones 1 a 6, caracterizada porque las cápsidas vacías están en forma de subunidades obtenidas mediante expresión del ADNc en células eucariotas, mediante un vector de expresión in vitro, bajo el control de un promotor inducible o de un promotor tardío de origen viral.

8. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 7, caracterizada porque el promotor es el promotor del bacteriófago T7 y las cápsidas vacías en forma de subunidades se obtienen mediante expresión del ADNc en presencia de la expresión de polimerasa T7.

9. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el vector de expresión es el virus vaccinia.

10. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque se formula en un medio que permite la conservación de las cápsidas vacías del tipo DMEM.

11. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende además un adyuvante.

12. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 11, caracterizada porque comprende dicha vacuna a modo de adyuvante hidroxilo de alúmina, saponina, avridina, ODA, un polímero del ácido acrílico o metacrílico, un polímero de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, o GM-CSF, o formulándose dicha vacuna en forma de una emulsión de agua en aceite, aceite en agua o agua en aceite en agua.

13. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 12, caracterizada porque el adyuvante comprende un carbómero.

14. Vacuna contra la fiebre aftosa, caracterizada porque comprende un vector de expresión que contiene ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsidél y ADNc de la región del genoma del virus aftoso que codifica para la proteasa 3C, de manera que se produce in vivo una cantidad eficaz de antígeno que consiste en cápsidas vacías del virus aftoso, comprendiendo la vacuna además un vehículo o excipiente farmacéutica mente aceptable desde el punto de vista veterinario, en la que el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ NO: 38 por un codón que codifica para una cisteína.

15. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 14, caracterizada porque el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido X6 de la secuencia X1 Gly X3 X4 Gly Xe Leu Xa Xg Ser X11 X12 Tyr Met en la que

- X4 Y X11 son Tyr, His o Phe,

- X3, Xa y X12 son Val, Met, lIe, Thr o Ala,

- X6 es His, Gln, Arg, Lys, Ser o Gly,

- X1 es His o Lys

- X9 es Asp, Glu o Lys;

por un codón que codifica para una cisteína.

16. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque las cápsidas vacias del virus aftoso comprenden las proteínas VPO, VP1 y VP3.

17. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque el ADNc que codifica para P1 también codifica para la totalidad o una parte de 2A.

18. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 17, caracterizada porque el ADNc también codifica para una parte de 28.

19. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque el ADNc que codifica para 3C también codifica para la totalidad o una parte de las proteínas 38, para una parte no funcional de 3D, o a la vez para la totalidad o una parte de las proteínas 38 y para una parte no funcional de 3D.

20. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 19, caracterizada porque el vector de expresión es un vector viral elegido de los poxvirus o los adenovirus replicativos.

21. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 20, caracterizada porque el vector de expresión es un poxvirus y el ADNc se coloca bajo el control de un promotor. tardío de origen viral elegido de P11 K del virus vaccinia, P28K del virus vaccinia y P160K ATI del virus de la viruela bovina.

22. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada porque el vector de expresión es un vector plasmídico y el ADNc se coloca bajo el control de un promotor elegido del grupo que consiste en el promotor temprano del virus SV40, el promotor L TR del virus de sarcoma de Rous y un promotor de un gen del citoesqueleto.

23. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, caracterizada porque comprende además un adyuvante.

24. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, comprendiendo dicha vacuna comprende un vector plasmídico y caracterizada porque el adyuvante comprende un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternario de fórmula

R10CH2CH (OR1) CH2N+ (CH3) 2 (R2lX

en la que R1 es un radical alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 ó 3 átomos de carbono, y X es un grupo hidroxilo o amina.

25. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 24, caracterizada porque el adyuvante comprende DMRIE.

26. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 25, caracterizada porque el DMRIE está asociado a DOPE para formar DMRIE-DOPE.

27. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, caracterizada porque comprende un vector viral y en la que el adyuvante comprende un polímero del ácido acrílico o metacrílico o un polímero de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo.

28. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, caracterizada porque el adyuvante contiene GMCSF.

29. Vacuna contra la fiebre aftosa, según la reivindicación 23, caracterizada porque el adyuvante contiene un vector que expresa GM-CSF in vivo.

30. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizada porque está dicha vacuna destinada a administrarse a un animal bovino.

31. Vacuna contra la fiebre aftosa, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizada porque se usa en un método de vacunación de un animal bovino.

32. Uso de cápsidas vacías del virus aftoso, obtenidas in vitro mediante la expresión en células eucariotas del ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso que codifica para la cápsida y del ADNc de la región del genoma del virus aftoso codifica para la proteasa 3C, para la fabricación de una vacuna contra la fiebre aftosa destinada a administrarse a un animal bovino, caracterizado porque el ADNc de la región P1 del genoma del virus aftoso se modifica mediante sustitución del codón que codifica para el aminoácido 179 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, o del codón que codifica para el aminoácido correspondiente al aminoácido 179 de .Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 por un codón que codifica para una cisteina.