VACUNA DE ADN PARA PERROS.

Vacuna de ADN contra el virus de la enfermedad canino (CDV) que afecta a los perros,

que comprende un plásmido que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para un inmunógeno de CDV, y los elementos necesarios para su expresión in vivo, un lípido catiónico, (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1 propanoamonio (DMRIE) y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), en el cual la vacuna de ADN administrada por vía intramuscular o subcutánea induce una respuesta inmunitaria eficaz y protectora en perros contra la CDV

La presente invención se refiere a vacunas de ADN mejoradas para los perros.

La utilización de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para la vacunación es conocida desde el principio de los años 90 (Wolf y al. Science 1990. 247. 1465-1468). Esta técnica de vacunación induce una inmunidad celular y humoral tras la transfección in vivo de células del sujeto a vacunar por unas moléculas de ADN o de aRN codifican y que expresan proteínas inmunologicamente activas.

Una vacuna de ADN se compone de al menos un plásmido que puede ser expresado por la maquinaria celular del sujeto a vacunar y de un vehículo o de un excipiente farmacéuticamente aceptable. La secuencia nucleotídica de este plásmido codifica y expresa, entre otros, uno o varios inmunógenos, tales como proteínas o glicoproteínas capaces de inducir, en el sujeto a vacunar, una respuesta inmunitaria celular (movilización de los linfocitos T) y humoral (estimulación de la producción de anticuerpos específicamente dirigidos contra el inmunógeno) (Davis H. L. Current Opinion Biotech. 1997.8. 635-640).

Todos los inmunógenos provenientes de un patógeno no son antígenos bastante eficaces naturalmente para inducir una respuesta inmunitaria protectora óptima en el animal a vacunar. Es por lo tanto necesario mejorar la respuesta inmunitaria.

Cada vía de administración comprende sus propias restricciones y dificultades; así una vacuna de ADN eficaz por una vía de administración puede ser ineficaz por otra.

La elección de la vía de administración debe tener en cuenta necesidades de los enfermeros y de los criadores, dificultades ligadas a la contención de los animales o a la naturaleza del producto.

Aunque pueda ser utilizada la vía intramuscular, la vía subcutánea presenta un gran interés para la vacunación de los animales de compañía, sobre todo para los animales de pequeño tamaño y de manipulación difícil.

Por lo tanto, las vacunas de ADN deben mejorarse para permitir su administración eficaz por unas vías diferentes.

Ya se han utilizado vacunas de ADN experimentalmente, en especial una vacuna de ADN que codifica para la hemaglutinina (HA) del virus de la rubéola (Etchart y al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580) cuya administración intranasal en los ratones ha mostrado ser más eficaz que una administración oral. En otro ejemplo, una vacuna de ADN que codifica para la proteína de la envoltura (Env) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) cuya administración subcutánea no ha sido eficaz en comparación con la administración por la vía intramuscular (Ishii y al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421-1428).0

Las vacunas de ADN también se han utilizado experimentalmente contra virus de animales, en especial contra los virus de la enfermedad canino (CDV). Son conocidos determinados inmunógenos de CDV, en especial la proteína de nucleocápside (N), la proteína de matriz (M), la proteína de fusión (F) y la hemaglutinina (HA) (WO-A9741236). Sin embargo, la administración subcutánea de una vacuna de ADN que codifica para la hemaglutinina y la proteína de fusión de CDV no han permitido detectar la producción de anticuerpos en ratones, y únicamente una reducida producción de anticuerpos tras la administración intramuscular de esta vacuna de ADN (Sixt y al. J. Virol. 1998. 72. 8472-8476).

La inducción de una respuesta inmunitaria y las relaciones entre los diferentes elementos del sistema inmunitario que intervienen durante esta respuesta pueden ser diferentes entre una especie animal y otra. Las numerosas enseñanzas sacadas de los experimentos llevados en el modelo ratón han permitido comprender mejor el funcionamiento del sistema inmunitario en los ratones, pero estas enseñanzas no son directamente transferibles a las otras especies, en especial porque es más fácil inducir una respuesta inmunitaria en los ratones que en las otras especies (van Drunen Little-van den Hurk y al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 831-839; Bôhm y al. Vacunae 1998. 16. 949954).

Se han propuesto diferentes vías de administración de la vacuna de ADN (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, mucosa, etc.). También se han propuesto diferentes medios de administración, en especial partículas de oro cubiertas de ADN y proyectadas de tal manera que puedan penetrar en las células de la piel del sujeto a vacunar (Tang y al. nature 1992. 356. 152-154) y los inyectores por chorro líquido que permiten transfectar a la vez células de la piel y células de los tejidos subyacentes (Furth y al. Analytical Bioch. 1992. 205. 365-368).

Se han utilizado compuestos químicos para la transfección in vitro de ADN:

A/ - los lípidos catiónicos.

Los lípidos catiónicos se dividen a su vez en cuatro sub-grupos.

1) los lípidos catiónicos que contienen sales de amonio cuaternario, como por ejemplo el DOTMA (dioleoitoxipropiltrimetilamonio, producido por Gibco con el nombre de Lipofectina), el DOTAP (trimetil- 2,3-(octadec-9-ene-oiloxi)-1propanamonio; Gregoriadis y al. FEBS Letters 1997. 402. 107-110), el DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio; WO-A-9634109), el DLRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodeciloxi)-lpropanamonio; Felgner y al. Ann. N Y Acad. Sci. 1995. 772. 126-139). Estos lípidos catiónicos que contienen sales de amonio cuaternario pueden ser asociados o no con un lípido neutro suplementario, tal como el DOPC (dioleoilfosfatidil-colina) o el DOPE (dioleoil-fosfatidil- etanolamina) (J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994. 5. 382-389).

2) las lipoaminas, como por ejemplo el DOGS (dioctadecilamidoglicilspermina, producido por Promega con el nombre de Transfectam; Abdallah y al. Biol. Cell. 1995. 85. 1-7), el DC-Chol (dimetilaminoetano-carbamoilcolesterol; Gao y Huang, Biochem. Biophys. Res. Común. 1991. 179. 280-285), el BGSC (bis-guanidinaspermidina- colesterol), el BGTC (bis-guanidina-tren-colesterol) (Vigneron y al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. 93. 9682-9686).

3) los lípidos catiónicos que contienen sales de amonio cuaternario y lipoaminas, como por ejemplo el DOSPA (N,Ndimetil-N-(2-(sperminacarboxamido) etil)-2, 3-bis(dioleoiloxi)-1-propanimidio pentahidrocloruro, comercializado por Gibco con el nombre de LipofectAmine®; Hawley-Nelson y al. Focus 1993. 15. 73-79), el GAP-DLRIE (N-(3aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodeciloxi)-i-propanaminio; Wheeler y al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. 93. 11454-11459; Norman y al. Vacine 1997. 15. 801-803).

4) los lípidos que contienen sales de amidina, como por ejemplo el ADPDE, el ADODE (Ruysschaert y al. Biochem. Biophys. Res. Común. 1994. 203. 1622-1628).

B/ - los polímeros, como por ejemplo el SuperFect™ (moléculas de dendrímeros activados, producidos por Qiagen; Xu y al. Mol. Genet. Metab. 1998. 64. 193-197), y

C/ - los agentes bioquímicos, como por ejemplo las toxinas, en especial las toxinas coléricas.

Determinados de estos compuestos también se han utilizado en la formulación de vacunas de ADN con resultados más que mitigados. Los conocimientos en materia de transfección in vitro no son trasladables a la vacunación ADN donde el objetivo final es asegurar una reacción inmunitaria protectora. También se han constatado efectos negativos en la inducción de una protección inmunitaria eficaz con compuestos conocidos para favorecer la transfección in vitro. Determinados compuestos químicos de formulación son tóxicos en dosis para las células transfectadas.

En los trabajos de Etchart ya citados (Etchart y al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580), la utilización del DOTAP no ha tenido efecto adyuvante durante la administración de la vacuna de ADN por la vía intranasal, mientras que si lo tuvo por la vía oral. El DOTAP también se ha utilizado en vacunas de ADN que codifican para la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe en el modelo ratón administrados por la vía intranasal (Ban y al. Vacunae 1997. 15. 811-813), pero la adición de DOTAP ha inhibido la respuesta inmunitaria. La utilización de DC-Chol o de DOTAP/DOPE en vacunas de ADN que codifican para la proteína de superficie (S) del virus de la hepatitis B en el modelo ratón administrados por la vía intramuscular ha permitido aumentar la respuesta en anticuerpos, mientras que la utilización de la Lipofectina (o DOTMA) no ha aumentado esta respuesta (Gregoriadis y al. FEBS Letters 1997. 402. 107-110). El DC-Chol/DOPE también se ha utilizado en vacunas de ADN contra... [Seguir leyendo]

1. Vacuna de ADN contra el virus de la enfermedad canino (CDV) que afecta a los perros, que comprende un plásmido que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para un inmunógeno de CDV, y los elementos necesarios para su expresión in vivo, un lípido catiónico, (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1 propanoamonio (DMRIE) y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), en el cual la vacuna de ADN administrada por vía intramuscular o subcutánea induce una respuesta inmunitaria eficaz y protectora en perros contra la CDV.

2. Vacuna según la reivindicación 1, que comprende además una proteína GM-CSF canina.

3. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un vector de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína GM-CSF canina en condiciones que permiten la expresión in vivo de esta secuencia.

4. Vacuna según la reivindicación 3, en el cual el vector de expresión es un plásmido.

5. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la secuencia nucleotídica que codifica para un inmunógeno de CDV es la secuencia de un gen del cual se ha eliminado la parte que codifica para el dominio transmembrana.

6. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el plásmido que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un inmunógeno de CDV comprende también una secuencia nucleotídica que codifica para una señal tPA.

7. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual el plásmido que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para un inmunógeno de CDV comprende también un intrón estabilizador.

8. Vacuna según la reivindicación 7, en el cual el intrón estabilizador es el intrón II del gen de la beta-globina del conejo.

9. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el plásmido contiene una secuencia nucleotídica que codifica para el antígeno HA de CDV.

10. Vacuna según la reivindicación 9, en el cual la secuencia nucleotídica que codifica para el antígeno HA está optimizada mediante la substitución de la secuencia que codifica para la señal de HA por una secuencia nucleotídica que codifica para una señal tPA, mediante la eliminación del fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio transmembrana de HA, mediante la inserción de un intrón en dirección 5' de la secuencia nucleotídica que codifica para HA o mediante una combinación de estas modificaciones.

11. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el plásmido contiene una secuencia nucleotídica que codifica para el antígeno F de CDV.

12. Vacuna según la reivindicación 11, en el cual la secuencia nucleotídica que codifica para el antígeno F está optimizada mediante la substitución de la secuencia que codifica para la señal de F por una secuencia nucleotídica que codifica para una señal tPA, mediante la eliminación del fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio transmembrana de F, mediante la inserción de un intrón en dirección 5' de la secuencia nucleotídica que codifica para F o mediante una combinación de estas modificaciones.

13. Vacuna según la reivindicación 10 o la reivindicación 12, en el cual la señal tPA es la señal tPA humana.

14. Vacuna según la reivindicación 10 o la reivindicación 12, en el cual el intrón es el intrón II de la beta globina del conejo.

15. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que comprende además, en el mismo plásmido o en otro plásmido, una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína M o la proteína N de CDV.

16. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que comprende un primer plásmido de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para el antígeno HA de CDV optimizada mediante la substitución de la secuencia que codifica para la señal de HA por una secuencia nucleotídica que codifica para la señal tPA humana, mediante la eliminación del fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio transmembrana de HA y mediante la inserción del intrón II del gen de la beta-globina del conejo en dirección 5' de la secuencia nucleotídica que codifica para HA, y de un segundo plásmido de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para el antígeno F de CDV optimizada mediante la eliminación del fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio transmembrana de F y mediante la inserción del intrón II de la beta-globina del conejo en dirección 5' de la secuencia nucleotídica que codifica para F.

17. Vacuna según la reivindicación 16, que comprende además un plásmido de expresión que codifica para el GMCSF canino.