Circovirus porcino, ácidos nucleicos, polipéptidos y vacunas.

Vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de un circovirus porcino de tipo II (PCV II) responsable del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS),

en el que dicha secuencia de nucleótidos del vector comprende un marco abierto de lectura (MAL) del circovirus porcino de tipo II (PCV II), seleccionándose dicho marco abierto de lectura del grupo constituido por:

- el marco abierto de lectura 4 (MAL 4) constituido por los nucleótidos 398 a 1342 de la hebra en sentido de la secuencia de referencia SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6,

- el marco abierto de lectura 13 (MAL 13) constituido por los nucleótidos 314 a 1377 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2 o los nucleótidos 314 a 1381 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6,

- el marco abierto de lectura 7 (MAL 7) constituido por los nucleótidos 1018 a 704 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6, y

- el marco abierto de lectura 10 (MAL 10) constituido por los nucleótidos 912 a 733 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6,

expresando dicho vector de expresión in vitro o in vivo dicho marco abierto de lectura del circovirus porcino de tipo II.

Circovirus porcino, ácidos nucleicos, polipéptidos y vacunas Sector de la técnica

La presente invención se relaciona con nuevas cepas de circovirus porcino (PCV para Porcine Circo Virus) responsables del síndrome PMWS {Porcine Muitisystemic Wasting Syndromeo Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome, también denominado síndrome del debilitamiento generalizado posterior al destete), así como con métodos que permiten su detección, métodos de vacunación y vacunas, así como con métodos de producción de estos reactivos y vacunas.

Estado de la técnica

El PCV ha sido el origen detectado como contaminante no citopatógeno en líneas celulares de riñones de cerdos PK/16. Este virus fue clasificado entre los Circoviridae con el virus de la anemia del polio (CAV para Chicken Anemia Virus) y el virus PBFDV (Psittacine Beak and Feather Disease Virus). Se trata de pequeños virus (de 15 a 24 nm) no envueltos cuya característica común es contener un genoma en forma de ADN de una sola hebra circular de 1,76 a 2,31 kb. Primeramente se pensó que este genoma codificaba un polipéptido de aproximadamente 30 kDa (Todd y col., Arch. Virol. 1991, 117: 129-135). Trabajos recientes han mostrado, sin embargo, una transcripción más compleja (Meehan B.M. y col., 1997, 78: 221-227). Además, no se conocen homologías significativas de secuencia nucleotídica ni de determinantes antigénicos comunes entre los tres tipos de circovirus conocidos.

El PCV resultante de células PK/16 es considerado como no patógeno. Se conoce la secuencia gracias a B.M. Meehan y col., J. Gen. Virol. 1997 (78), 221-227. No ha sido sino muy recientemente que los autores han pensado que cepas del PCV podían ser patógenas y estar asociadas al síndrome PMWS (Gupi PS. Nayar y col., Can. Vet. J., Vol. 38. 1997: 385-387, y Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501). Nayar y col., detectaron ADN de PCV en cerdos que presentaban el síndrome PMWS por técnicas de PCR. Sin embargo, hasta ahora no se ha aislado ni purificado ninguna cepa silvestre del PCV.

El síndrome PMWS detectado en Canadá, en los Estados Unidos y en Francia, se caracteriza desde el punto de vista químico por una pérdida progresiva de peso y por manifestaciones tales como taquipnea, disnea e ictericia. Desde el punto de vista patológico, se traduce por infiltraciones linfocitarias o granulomatosas, linfadenopatías y, más raramente, por hepatitis y nefritis linfocitarias o granulomatosas (Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac, 1997: 499-501; La Semaine Veterinaire N° 26, suplemento a la Semaine Veterinaire 1996 (834); La Semaine Veterinaire, 1997 (857): 54; Gupi, PS., Nayar y col., Can. Vet. J., Vol. 38, 1997: 386-387).

La solicitante ha conseguido aislar cinco nuevas cepas de PCV a partir de muestras pulmonares o ganglionares procedentes de granjas situadas en Canadá, en los Estados Unidos (California) y en Francia (Bretaña), en lo sucesivo denominados circovirus según la invención. Estos virus se han puesto de manifiesto en lesiones de cerdos afectados por el síndrome PMWS, pero no en cerdos sanos.

La solicitante ha secuenciado además el genoma de cuatro de estas cepas, a saber, las cepas procedentes del Canadá y de los Estados Unidos, así como dos cepas francesas. Las cepas presentan entre sí una fuerte homología a nivel nucleotídico, que sobrepasa el 96%, y mucho más débil con la cepa PK/16, de aproximadamente el 76%. Las nuevas cepas pueden considerarse por tanto representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, denominado en el presente documento tipo II, estando representado el tipo I por la PK/15.

Objeto de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones y describe el circovirus porcino del grupo II, tal como se ha definido anteriormente, aislado o en forma de preparación purificada.

También se describe cualquier circovirus porcino susceptible de ser aislado de una muestra fisiológica o de una muestra tisular, especialmente de lesiones, de un cerdo enfermo que presente el síndrome PMWS, especialmente siguiendo el método descrito en los ejemplos, en particular con el circovirus de tipo II.

La presente invención describe más particularmente preparaciones purificadas de cinco cepas, que fueron depositadas en la ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido) el jueves 2 de octubre de 1997:

-N°de acceso V97100219 (denominado en el presente documento lmp.1008PCV),

-N°de acceso V97100218 (denominado en el presente documento lmp.1010PCV),

-N°de acceso V97100217 (denominado en el presente documento lmp.999PCV),

y el viernes 16 de enero de 1998:

-N0 de acceso V98 011608 (denominado en el presente documento Imp. 1011 -48285),

-N0 de acceso V98 011609 (denominado en el presente documento Imp. 1011 -48121).

La invención pretende considerar los circovirus porcinos aislados de un cerdo enfermo y/o los circovirus que tengan un parentesco serológico significativo con las cepas de la invención y/o los circovirus que tengan una hibridación cruzada con las cepas de la invención en condiciones estrictas tales que no haya hibridación con la cepa PCV PK/15.

Las cepas víricas aisladas de una muestra fisiológica o de una muestra tisular, especialmente de una lesión, de un cerdo que presente el síndrome PMWS pueden propagarse ventajosamente en líneas celulares tales como especialmente líneas celulares de riñón de cerdo, en particular células PK/15 indemnes a la contaminación (en particular para PCV, así como para pestivirus, adenovirus porcino y parvovirus porcino) con vistas a su multiplicación o específicamente para la producción de antígeno, entero (por ejemplo, virus) y/o subunidades (por ejemplo, polipéptidos).

De un modo muy notable e inesperado, estos aislados han mostrado ser muy productivos en cultivo sobre células PK/15, lo que presenta ventajas innegables para la producción de virus o de antígeno, en particular para la producción de vacuna inactivada.

También se describen preparaciones de circovirus aislados después de hacer pases sobre células, especialmente líneas celulares, por ejemplo células PK, cultivadas in vitro estando infectadas por al menos uno de los circovirus descritos en el presente documento, o de cualquier circovirus susceptible de ser aislado de una muestra fisiológica o de una muestra tisular, especialmente de lesiones, de un cerdo que presente el síndrome PMWS. También se describen sobrenadantes o extractos de cultivo, eventualmente purificados por técnicas estándar, y de forma general cualquier preparación antigénica obtenida a partir de los cultivos in vitro.

También se describen los principios activos inmunogénicos y las vacunas que contienen al menos un antígeno tal como se define anteriormente.

Puede tratarse de principios activos inmunogénicos basados en virus enteros vivos atenuados, o vacunas preparadas con estos principios activos, efectuándose la atenuación de acuerdo con los métodos habituales, por ejemplo, realizando pases sobre células, preferentemente pases sobre células de cerdo, particularmente líneas, tales como las células PK/15 (por ejemplo de 50 a 150, particularmente del orden de 100 pases). Estas vacunas comprenden en general un vehículo o un diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario, eventualmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario así como eventualmente un estabilizador de liofilización.

Estas preparaciones antigénicas y vacunas comprenderán preferentemente de 103 a 106 DICT50.

También puede tratarse de principios activos inmunogénicos o de vacunas basadas en antígenos de circovirus de acuerdo con la invención, en estado inactivado. Las vacunas comprenden adicionalmente un vehículo o un diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario eventualmente con un adyuvante adicional aceptable desde el punto de vista veterinario.

Los circovirus, con las fracciones que puedan estar presentes, son inactivados según técnicas conocidas por el experto en la materia. Se efectuara la inactivación preferiblemente por vía química, por ejemplo, por exposición del antígeno a un agente químico tal como formaldehido (formol), paraformaldehido, y p-propiolactona o etilenimina o sus derivados. En el presente documento el método de inactivación preferido será la exposición a un agente químico y, en particular, a etilenimina o a la p-propiolactona.

Preferentemente, las vacunas inactivadas divulgadas serán adyuvantes, presentándose ventajosamente en forma de emulsiones, por ejemplo, de agua en aceite o de aceite en agua, según las técnicas bien conocidas por el experto en la... [Seguir leyendo]

1. Vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de un circovirus porcino de tipo II (PCV II) responsable del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS), en el que dicha secuencia de nucleótidos del vector comprende un marco abierto de lectura (MAL) del circovirus porcino de tipo II (PCV II), seleccionándose dicho marco abierto de lectura del grupo constituido por:

- el marco abierto de lectura 4 (MAL 4) constituido por los nucleótidos 398 a 1342 de la hebra en sentido de la secuencia de referencia SEC ID N2: 1, SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6,

- el marco abierto de lectura 13 (MAL 13) constituido por los nucleótidos 314 a 1377 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID N2: 1 o SEC ID N2: 2 o los nucleótidos 314 a 1381 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6,

- el marco abierto de lectura 7 (MAL 7) constituido por los nucleótidos 1018 a 704 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID N2: 1, SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6, y

- el marco abierto de lectura 10 (MAL 10) constituido por los nucleótidos 912 a 733 de la hebra antisentido de la secuencia de referencia SEC ID N2: 1, SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6,

expresando dicho vector de expresión in vitro o in vivo dicho marco abierto de lectura del circovirus porcino de tipo II.

2. Vector de expresión según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos del vector comprende el marco abierto de lectura 4 (MAL 4) o el marco abierto de lectura 13 (MAL 13).

3. Vector de expresión según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector es un baculovirus o un plásmido.

4. Vector de expresión según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector es apropiado para la expresión in vivo.

5. Vector de expresión según la reivindicación 4, en el que el vector es un virus vivo o un plásmido.

6. Vector de expresión según la reivindicación 5, en el que el vector se selecciona entre el herpesvirus de cerdo, el adenovirus porcino y los poxvirus.

7. Vector de expresión según la reivindicación 6, en el que el vector se selecciona entre el virus de la enfermedad de Aujeszky, el virus de la vacuna, de la viruela aviar y de la viruela porcina.

8. Vector de expresión según la reivindicación 7, en el que el vector es el virus de la viruela del canario.

9. Vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el vector de expresión se utiliza para inducir una respuesta inmunitaria en el cerdo contra un circovirus porcino de tipo II (PCV II).

10. Una célula que expresa in vitro un polipéptido de un circovirus porcino de tipo II (PCV II), comprendiendo la célula un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Célula según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula de E. coli o una célula eucariota.

12. Célula según la reivindicación 11, en la que la célula eucariota es una levadura.

13. Célula según la reivindicación 11, en la que la célula eucariota es una célula de mamífero.

14. Célula según la reivindicación 11, en la que la célula eucariota es una célula de insecto.

15. Polipéptido codificado por un fragmento de ADN que comprende un marco abierto de lectura (MAL) de un circovirus porcino de tipo II (PCV II), seleccionándose el marco abierto de lectura del grupo constituido por:

- el marco abierto de lectura 4 (MAL 4) constituido por los nucleótidos 398 a 1342 de la hebra sentido de la secuencia de referencia SEC ID N2: 1, SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6,

- el marco abierto de lectura 13 (MAL 13) constituido por los nucleótidos 314 a 1377 de la hebra antisentido de la

secuencia de referencia SEC ID N2: 1 o SEC ID N2: 2 o los nucleótidos 314 a 1381 de la hebra antisentido de la

secuencia de referencia SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6,

- el marco abierto de lectura 7 (MAL 7) constituido por los nucleótidos 1018 a 704 de la hebra antisentido de la

secuencia de referencia SEC ID N2: 1, SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6, y

- el marco abierto de lectura 10 (MAL 10) constituido por los nucleótidos 912 a 733 de la hebra antisentido de la

secuencia de referencia SEC ID N2: 1, SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3, SEC ID N2: 4 o SEC ID N2: 6,

16. Polipéptido según la reivindicación 15, en el que el marco abierto de lectura del PCV II es el marco abierto de lectura 4 (MAL 4) o el marco abierto de lectura 13 (MAL 13).

17. Polipéptido según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el polipéptido se utiliza para inducir una 5 respuesta inmunitaria en el cerdo contra un circovirus porcino de tipo II (PCV II).

18. Vacuna subunitaria que comprende al menos un polipéptido de la reivindicación 15 o de la reivindicación 16, en un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario.

19. Vacuna subunitaria según la reivindicación 18 que comprende adicionalmente un adyuvante aceptable desde el

punto de vista veterinario.

20. Vacuna que comprende al menos un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 en un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario.