GM-CSF EQUINO.

Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad para equinos que comprende un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de nucleótidos SEQ ID N:

8 que codifica el GM-CSF equino, en condiciones que permiten la expresión en el caballo de una proteína GM-CSF equina funcional

GM-CSF equino.

La presente invención se refiere a la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la citocina GM-CSF de caballo, vectores de expresión que la contienen, y su utilización como adyuvante en la vacunación de equinos y para estimular la inmunidad inespecífica.

El primer descubrimiento de un factor de estimulación de la formación de colonias de granulocitos macrófagos (en inglés "Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor" o GM-CSF) fue en 1977 (A. Burgess W. et al. J. Biol. Chem.. 1977. 252. 1998-2003). Este es el GM-CSF murino, purificado a partir de sobrenadante de cultivo de los pulmones de los ratones.

Las actividades biológicas del GM-CSF se han destacado por trabajar en el GM-CSF murino y humano (Clark S. C. et al. Science 1987. 230. 1229; S. Grant M. et al. Drugs 1992. 53. 516).

El GM-CSF tiene muchas funciones fisiológicas (Dy M en "Les cytokines" Cavaillon JM, 1996, ed. Masson, París, Francia, 43-56). En particular, el GM-CSF estimula la producción, el desarrollo, la formación de colonias de granulocitos, macrófagos, eosinófilos y megacariocitos. El GM-CSF induce la citotoxicidad específica en los macrófagos, estimula la actividad citotóxica de los anticuerpos dependientes (ADCC) y la acumulación de leucocitos en los sitios de inflamación.

El GM-CSF en diferentes especies animales ya se han puesto en evidencia.

Los tamaños de las secuencias de nucleótidos que codifican el GM-CSF conocido de diferentes especies varían entre 381 y 432 nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos humanos y murinos tienen un grado de homología del 69%. El grado de homología es del 54% en la secuencia de aminoácidos (Cantrell M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1985. 82. 6250-6254). Sin embargo, esta homología no permite la reactividad cruzada entre la especie humana y murina (Metcalf D. et al. Blood 1986. 67. 37-45).

La administración de GM-CSF heterólogo, es decir, de una especie diferente a la tratada, no proporciona un efecto adyuvante óptimo, incluyendo la estimulación de la actividad de las células hematopoyéticas y un aumento substancial de la respuesta inmune.

Hasta la fecha, el GM-CSF equino no ha podido ser identificado. Sin embargo, esta citocina tiene un gran interés para aplicaciones terapéuticas y de vacunas para uso en caballos.

El solicitante ha conseguido aislar y secuenciar el gen del GM-CSF equino. Este gen ha sido aislado después de la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR o ACP) con la ayuda de los oligonucleótidos descritos en los ejemplos.

El gen del GM-CSF equino tiene un tamaño de 432 nucleótidos (SEQ ID No. 8 y Figura 1) y codifica una proteína de 144 aminoácidos (SEQ ID No. 9 y Figura 1). La proteína codificada por este gen tiene una homología de al menos un 75% con las secuencias de polipéptido de GM-CSF de otras especies.

La presente invención se refiere pues a un fragmento de ADN aislado que codifica el GM-CSF equino, que comprende la SEQ ID No. 8. También tiene por objeto un fragmento de ADN que tiene, o consiste esencialmente en, esta secuencia.

La presente invención también se refiere a un fragmento de ADN aislado que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 9.

También tiene como objetivo fragmentos de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el GM-CSF equino, como SEQ ID No. 8 o una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 9, estando asociada esta secuencia de nucleótidos, en fusión, con la secuencia de nucleótidos que codifica al menos un inmunógeno o al menos un fragmento inmunológicamente activo, o al menos, un epítope de un inmunógeno. El fragmento de ADN no comprende entonces codones de detención entre la secuencia de codificación para el GM-CSF y la secuencia inmunogénica asociada. Por ejemplo, si uno se refiere a la SEQ ID No. 8, la secuencia de codificación insertada termina en el nucleótido 432, y no incluye el codón de detención.

La presente invención se refiere también a la proteína o polipéptido GM-CSF equino aislado, que codifica la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 8.

La presente invención también tiene por objeto la proteína GM-CSF equina, teniendo la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 9.

La proteína GM-CSF equina tiene un tamaño de 144 aminoácidos. La presente invención también incluye las proteínas de fusión, siendo su actividad biológica (para la parte común con el GM-CSF) equivalente a la proteína GM-CSF natural equina in vivo en los caballos y su especificidad de especie no se modifica. Son entendidas como equivalentes las secuencias de aminoácidos codificadas por cualquiera de las secuencias de nucleótidos equivalentes definidas anteriormente.

La presente invención también proporciona una preparación pura de la proteína GM-CSF equina.

La presente invención tiene también por objeto vectores de expresión que contienen como inserción un fragmento de ADN o secuencias de nucleótidos definidas anteriormente, especialmente el gen GM-CSF equino (SEQ ID No. 8), o uno equivalente al mismo según lo definido anteriormente, y cualquier secuencia de nucleótidos que codifica para cualquier secuencia de aminoácidos según lo definido anteriormente. Del mismo modo, el vector puede comprender también una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un inmunógeno o por lo menos un fragmento inmunológicamente activo o, al menos, un epítope de un inmunógeno, que puede estar asociado o no a la fusión como se describe anteriormente.

La secuencia de nucleótidos que se puede insertar en sistemas de expresión in vitro clásicos, de origen viral tal como el baculovirus, incluyendo la propagación en células de insecto, o células de origen procariota (por ejemplo, Escherichia coli) o eucariota, en particular, las levaduras, particularmente Saccharomyces cerevisiae, las células eucariotas de mamíferos, particularmente las células de hámster (por ejemplo, células de ovario de hámster o CHO) y células de caballos. La invención, por lo tanto, también cubre estos sistemas de expresión transformados por una secuencia de la invención, las proteínas GM-CSF equinas así producidas, y su uso como adyuvante de vacuna y de estimulante no específico de la inmunidad.

Preferiblemente, la secuencia de la invención se introduce en vectores de expresión in vivo en condiciones que permitan la expresión en el caballo de una proteína GM-CSF equina funcional, y eventualmente una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un inmunógeno o por lo menos un fragmento inmunológicamente activo o, al menos, un epítope de un inmunógeno. Los vectores de expresión pueden ser plásmidos, vectores virales, como los virus de viruela, por ejemplo, virus de vacunas, viruela aviar (viruela de canario, de ave), incluidos los virus de viruela de determinadas especies (viruela porcina, viruela de mapache y viruela de camello), los adenovirus y los virus del herpes como el virus del herpes equino.

El término plásmido se entiende que abarca la totalidad de la unidad de transcripción de ADN en forma de una secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de los genes GM-CSF equinos y los elementos necesarios para la expresión in vivo. Nosotros preferimos la forma plásmida circular, superenrollada o no. La forma lineal también entra en el ámbito de aplicación de esta invención.

Cada plásmido comprende un promotor capaz de garantizar, dentro de las células huésped, la expresión del gen insertado bajo su dependencia. Por lo general, un promotor eucariota fuerte y, en particular, un promotor precoz de citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino, o incluso eventualmente de otro origen, tal como rata, cobaya. De manera más general, el promotor es de origen viral o celular. Como promotor viral distinto del CMV-IE, se pueden citar el promotor precoz o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus de sarcoma de Rous. También puede ser un promotor de virus proveniente del gen, por ejemplo el propio promotor del gen. Como promotor celular, se puede citar el promotor de un gen de citoesqueleto, como por ejemplo, el promotor de desmina, o el promotor de actina. Cuando múltiples genes están presentes en el mismo plásmido, pueden ser presentados en la misma unidad de transcripción o en dos unidades diferentes.

Los plásmidos pueden también comprender otros elementos de regulación de transcripción, como por ejemplo las secuencias estabilizadoras...

1. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad para equinos que comprende un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de nucleótidos SEQ ID N:8 que codifica el GM-CSF equino, en condiciones que permiten la expresión en el caballo de una proteína GM-CSF equina funcional.

2. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el vector es un vector viral o un plásmido.

3. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el vector viral se elige entre el grupo que consiste en virus de la viruela, adenovirus y virus del herpes.

4. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que el virus del herpes es un virus del herpes equino.

5. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que el virus de la viruela se elige en el grupo que consiste en virus de la viruela de la vaca, de canario, de ave, de cerdo, de mapache y de camello.

6. Composición de estimulación de la inmunidad para equinos, que comprende un estimulante no específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un excipiente o vehículo aceptable a nivel veterinario.

7. Composición inmunogénica o vacuna equina, que comprende un coadyuvante de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, una preparación inmunogénica o vaccínea contra un patógeno equino, y un excipiente o vehículo aceptable a nivel veterinario.

8. Composición inmunogénica o vacuna equina según la reivindicación 7, en la cual la preparación inmunogénica o vaccínea se elige entre el grupo que consiste en una preparación inactivada, viva reducida, de subunidades y recombinante.

9. Composición inmunogénica o vacuna equina que comprende un coadyuvante de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por el hecho de que el vector es un vector de expresión in vivo que contiene además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un inmunógeno equino o un fragmento inmunológicamente activo de un inmunógeno de un patógeno equino, y un excipiente o vehículo aceptable a nivel veterinario.

10. Composición inmunogénica o vacuna equina que comprende un coadyuvante de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y al menos un vector de expresión in vivo que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un inmunógeno equino o un fragmento inmunológicamente activo de un inmunógeno de un patógeno equino, y un excipiente o vehículo aceptable a nivel veterinario.

11. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad para equinos, que consiste en una proteína equina GM-CSF producida por un sistema de expresión que contiene y que expresa una secuencia de nucleótidos SEQ ID N:8.

12. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que el sistema de expresión es un vector de expresión in vitro de origen viral o plásmido.

13. Coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que el vector de expresión "in vitro" de origen viral es un baculovirus.

14. Procedimiento de producción de un coadyuvante de vacuna o estimulante no específico de la inmunidad para equinos, que comprende la transformación o la transfección de una célula in vitro mediante un sistema de expresión que contiene y que expresa una secuencia de nucleótidos SEQ ID N:8, y el cultivo de la célula en condiciones que permiten la expresión de la proteína GM-CSF equina que codifica dicha secuencia de nucleótidos SEQ ID N:8.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por el hecho de que la célula se elige entre el grupo que consiste en célula de insecto, célula procariota, célula eucariota, célula de levadura y célula de mamífero.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que la célula procariota es una célula E. coli.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que la célula de levadura es una célula Saccharomyces cerevisiae.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que la célula de mamífero es una célula de hámster.

19. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que la célula de mamífero es una célula de caballo.

20. Composición que estimula la inmunidad para equinos, que comprende un estimulante no específico según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, y un excipiente o vehículo aceptable a nivel veterinario.

21. Composición inmunogénica o vacuna equina que comprende un coadyuvante de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, una preparación inmunogénica o vaccínea contra un patógeno equino, y un excipiente o vehículo aceptable a nivel veterinario.

22. Composición inmunogénica o vacuna equina según la reivindicación 21, en la cual la preparación inmunogénica o vaccínea se elige entre el grupo que consiste en una preparación inactivada, viva reducida, de subunidades y recombinante.

23. Utilización de un estimulante no específico de la inmunidad según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 11, 12, ó 13 para la fabricación de una composición que estimula la inmunidad para equinos.

24. Utilización de un coadyuvante de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 11, 12, ó 13 para la fabricación de una composición inmunogénica o vacuna para equinos, que comprende por otro lado un inmunógeno equino o una preparación inmunogénica o vaccínea.