VACUNA DE VIRUS POX RECOMBINANTE CONTRA EL CIRCOVIRUS PORCINO.

Composicion inmunogenica que comprende (i) un virus pox recombinante que comprende una molecula de ADN aislada,

donde el virus pox es: ALVAC, o un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenua a traves de mas de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometio la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplifico un clon de placa a traves de cinco pases adicionales, y donde la molecula de ADN aislada comprende ORF2 de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2); y (ii) un portador

Descripción CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere a la utilización de virus pox recombinantes, por ejemplo, virus pox modificados, En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a la utilización de virus pox aviar, tal como virus pox de canario, por ejemplo, ALVAC. La presente invención se refiere además a composiciones inmunológicas o vacunas que comprenden virus pox que expresan ORF2 de circovirus porcino 2 (PCV2). La presente invención se refiere además a la utilización de virus pox que inducen una respuesta inmune dirigida a o contra ORF2 de PCV2 y/o PCV2; y, de manera ventajosa, a dichas composiciones que son composiciones inmunológicas, inmunogénicas o de vacuna y/o confieren inmunidad protectora contra la infección por PCV2. La presente invención se refiere además a las utilizaciones y métodos que utilizan dichos vectores y composiciones, así como intermedios de los mismos, y a dichos intermedios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] El síndrome del desmedro multisistémico post-destete (PMWS) es una enfermedad recientemente reconocida de los cerdos jóvenes. El PMWS se caracteriza clínicamente por una pérdida progresiva de peso y otros síntomas, tales como taquipnea, sipnea e ictericia. Patológicamente, se han observado infiltrados linfocíticos y granulomatosos, linfadenopatía y, más raramente, hepatitis y nefritis linfocíticas y granulomatosas (Clark, 1997; Harding. 1997). [0003] Esta enfermedad se ha descrito en diferentes países europeos, así como en Norteamérica. El tratamiento y la prevención de esta enfermedad no están actualmente disponibles. [0004] Varias líneas de evidencia apuntan hacia el circovirus porcino como el agente etiológico de PMWS (Ellis et al., 1998). Se han recuperado circovirus de credos con PMWS, y se han mostrado anticuerpos para circovirus porcino en cerdos con la enfermedad [0005] Los circovirus son virus de ADN circular monocatenario que se encuentran en una gama de especies de animales y plantas. El circovirus porcino se aisló originalmente como un contaminante de una línea continua de riñón de cerdo. El aislado del cultivo celular se ha designado como PK-15 (Meehan et al., 1997). Más recientemente, el circovirus porcino obtenido de cerdos con PMWS se ha comparado con PK-15. Dichos virus difieren sustancialmente de PK-15 a nivel de secuencia de nucleótidos y proteínas y se han designado como PCV2 (Meehan et al., 1998; Hamel et al., 1998). [0006] Se han identificado hasta trece marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma de PCV2 (COL1 a COL13 en la solicitud de patente francesa 98 03707). Cuatro de estos ORF comparten una homología sustancial con los ORF análogos en el genoma de PK-15. ORFI (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL4 en la solicitud de patente francesa 98 03707), que comprende los nucleótidos 398-1342 (GenBank número de acceso AF055392), tiene el potencial de codificar una proteína con un peso molecular previsto de 37,7 kD. ORF2 (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL13 en la solicitud de patente francesa 98 03707) que comprende los nucleótidos 13811768 unidos a 1-314 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular previsto de 27,8 kD. ORF3 (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL7 en la solicitud de patente francesa 98 03707), que comprende los nucleótidos 1018-704 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular previsto de 11,9 kD. ORF4 (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL10 en la solicitud de patente francesa 98 03707), que comprende los nucleótidos 912-733 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular previsto de 6,5 kD. [0007] ORF1 de PCV2 es altamente homólogo (identidad del 86%) con el ORF1 del aislado de PK-15 (Meehan et al., 1998). La proteína ORF1 de PK-15 se ha caracterizado parcialmente (Meehan et al., 1997; Mankertz et al., 1998a). Se sabe que es esencial para la replicación de virus y está probablemente implicado en la replicación del ADN viral. [0008] La identidad en la secuencia de proteínas entre los ORF2 respectivos fue inferior (identidad del 66%) que la de los ORF1, pero cada uno de los ORF2 compartía una región N-terminal básica altamente conservada, similar a la observada en la región N-terminal de la proteína estructural principal del virus de la anemia de pollito (CAV) del circovirus aviar (Meehan et al., 1998). Recientemente, Mankertz et al. (1998b) ha sugerido que el ORF2 del aislado de PK-15 (designado ORF1 en Mankertz et al., 1998b) codifica una proteína de la cápside. [0009] Se observaron mayores diferencias entre los respectivos ORF3 y ORF4 del aislado de PK-15 y PCV2-En cada caso, hubo una deleción de la región C-terminal de ORF4 y ORF3 de PCV2 en comparación con el correspondiente ORF presente en el genoma del aislado de PK-15. La mayor homología en la secuencia de proteínas se observó en las regiones N-terminales de tanto ORF3 como ORF4 (Meehan et al., 1998).

El análisis de la transcripción del genoma de PCV2 no se ha publicado aún. Los datos recientes obtenidos con el aislado de PK-15 indicaron que el transcrito de ORF2 se corta y empalma (Mankertz et al., 1998b). [0011] Se han utilizado satisfactoriamente virus vaccinia para inmunizar contra la viruela, culminando en la erradicación mundial de la viruela en 1980. Con la erradicación de la viruela, el nuevo papel de los virus pox se ha vuelto importante, el de vector diseñado genéticamente para la expresión de genes exógenos (Panicali y Paoletti, 1982; Paoletti et al., 1984). Los genes que codifican antígenos heterólogos se han expresado en vaccinia, dando lugar a menudo en inmunidad protectora contra la estimulación por el correspondiente patógeno (revisado en Tartaglia et al., 1990). También se ha utilizado una cepa altamente atenuada de vacunas, designada MVA, como vector para vacunas basadas en virus pox. La utilización de MVA se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,185,146. [0012] Dos sistemas de vectores de vacuna adicionales implican la utilización de virus pox limitados a huéspedes naturales, virus pox aviares (avipox). Tanto el virus de la viruela aviar (FPV; Taylor et al. 1988a, b) como el virus pox de canario (CPV; Taylor et al., 1991 & 1992) se han diseñado para expresar de productos génicos exógenos. El virus de la viruela aviar (FPV) es el virus prototipo del género Avipox de la familia de los virus Pox. El virus causa una enfermedad de las aves de corral económicamente importante que ha estado bien controlada desde los años 20 mediante la utilización de vacunas atenuadas vivas. La replicación de los virus avipox está limitada a especies aviares (Matthews, 1982) y no existen informes en la literatura de virus avipox que causen una infección productiva en alguna especie no aviar, incluyendo el hombre. Esta limitación del huésped proporciona una barrera de seguridad inherente para la transmisión de los virus a otra especie y hace de la utilización de vectores de vacunas basadas en virus avipox en aplicaciones veterinaria y humana una proposición atractiva. [0013] Se ha utilizado FPV de manera ventajosa como vector que expresan antígenos de patógenos de aves de corral. La proteína hemaglutinina de un virus de la gripe aviar virulenta se expresó en un FPV recombinante (Taylor et al., 1988c). Después de la inoculación del recombinante en pollitos y pavos, se indujo una respuesta inmune que era protectora contra la estimulación con virus de la gripe homólogo o heterólogo (Taylor et al., 1988c). También se han desarrollado recombinantes de FPV que expresan las glicoproteínas de superficie del Virus de la Enfermedad de Newcastle (Taylor et al., 1990 ; Edbauer et al., 1990). [0014] Se han preparado otros virus pox atenuados mediante modificaciones genéticas de cepas de tipo salvaje del virus. El vector NYVAC, derivado por deleción de genes de virulencia específica y de diversos huéspedes de la cepa Copenhagen de vaccinia (Tartaglia et al., 1992), ha demostrado ser útil como vector recombinante en la obtención de una respuesta inmune protectora contra un antígeno exógeno expresado. [0015] Otro vector de virus pox diseñado en ALVAC, derivado del virus pox de canario. ALVAC no se replica de manera productiva en huéspedes no aviares, una característica que se cree que mejora el perfil de seguridad (Taylor et al., 1991 & 1992). Tanto ALVAC como NYVAC son vectores BSL-1. [0016] Una estrategia para el desarrollo de una vacuna de subunidad PCV2 es la utilización de vectores virales vivos para expresar ORF de PCV2 relevantes. Los virus pox recombinantes se pueden construir en dos etapas conocidas en la técnica y análogas a los métodos para crear recombinantes sintéticos de virus pox, tales como el virus vaccinia y virus...

1. Composición inmunogénica que comprende (i) un virus pox

recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es:

ALVAC, o

un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2);

y (ii) un portador.

2. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, donde el virus pox recombinante es un virus pox de canario ALVAC recombinante.

3. Composición inmunogénica según la reivindicación 1 ó 2, donde la molécula de ADN aislada comprende ORF1 de PCV2 y ORF2 y PCV2.

4. Composición inmunogénica según la reivindicación 3, donde dicho ALVAC tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 1 y dicho locus C6 se encuentra en una posición de 377 a 2254 de la SEC ID No 1 y donde la molécula de ADN aislada se encuentra en el locus C6 del genoma de virus pox de canario ALVAC.

5. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene un adyuvante.

6. Composición inmunogénica según la reivindicación 5, donde el adyuvante es un carbómero.

7. Utilización de un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es:

ALVAC, o

un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de PCV2;

para la preparación de una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune contra PCV2 en un cerdo adulto, un cerdo joven o una cerda gestante.

8. Utilización según la reivindicación 7, donde la composición inmunogénica se administra a una cerda antes de aparearse y de nuevo durante la gestación.

9. Utilización según la reivindicación 8, donde la composición inmunogénica se administra durante la gestación en aproximadamente las semanas 6-8 de gestación y/o aproximadamente las semanas 11-13 de gestación.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para conferir inmunidad pasiva a un lechón recién nacido.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la composición inmunogénica se administra a una hembra gestante y a continuación a su lechón o lechones después del nacimiento.

12. Utilización según la reivindicación 7 u 11, donde la composición inmunogénica se administra a un lechón entre el nacimiento y el destete.

13. Utilización según la reivindicación 12, donde la composición inmunogénica se administra a un lechón en la primera semana de vida o en la tercera semana de vida, y preferiblemente se administra de nuevo de dos a cuatro semanas más tarde.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, donde la composición inmunogénica contiene un adyuvante.

15. Utilización según la reivindicación 14, donde el adyuvante es un carbómero.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, donde la molécula de ADN aislada comprende ORF1 de PCV2 y ORF2 de PCV2.

17. Vacuna que comprende (i) un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es:

ALVAC, o

un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones en placa sucesivas bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales,

y donde la molécula de ADN aislada comprende el ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2); y (ii) un portador.

18. Vacuna según la reivindicación 17, donde el virus pox recombinante es un virus pox de canario ALVAC recombinante.

19. Vacuna según la reivindicación 17 ó 18, donde la molécula de ADN aislada comprende ORF1 de PCV2 y ORF2 de PCV2.

20. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde dicho ALVAC tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 1 y dicho locus C6 se encuentra en la posición 377 a 2254 de SEC ID No 1 y donde la molécula de ADN aislada se

5 encuentra en el locus C6 del genoma del virus pox de canario de ALVAC.

21. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que contiene un adyuvante.

22. Vacuna según la reivindicación 21, donde el adyuvante es un carbómero.