Un método para una evolución molecular in vitro de una función proteínica.

Un método para generar una secuencia o una población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias de polinucleótidos madre de hebra sencilla que codifican uno o más motivos de proteína,

que comprende los pasos de:

a) proporcionar ADN de hebra sencilla que constituye hebras de más y menos de las secuencias de polinucleótido madre;

b) digerir las secuencias de polinucleótidos de hebra sencilla con una exonucleasa para generar poblaciones de fragmentos de hebra sencillas;

c) poner en contacto dichos fragmentos generados de las hebras más con fragmentos generados de las hebras menos y opcionalmente, añadir las secuencias de plantilla que se fusionan a terminales 3'' y 5'' de al menos uno de los polinucleótidos madre en condiciones de fusión;

d) amplificar los fragmentos que se fusionan entre sí para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína teniendo características alteradas en comparación con el uno o más motivos de proteína codificados por dichos polinucleótidos madre.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2001/014744.

Solicitante: ALLIGATOR BIOSCIENCE AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: SCHEELEVAGEN 19A 223 70 LUND SUECIA.

Inventor/es: CARLSSON, ROLAND, FUREBRING, CHRISTINA, MALMBORG HAGER, ANN-CHRISTIN, BORREBAECK, CARL.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61P43/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Medicamentos para usos específicos, no previstos en los grupos A61P 1/00 - A61P 41/00.
  • C12N15/09 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Un método para una evolución molecular in vitro de una función proteínica.

Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a un método para la evolución molecular en vitro de la función proteína, en particular para combinar los segmentos de ADN de hebra sencilla obtenidos usando una nucleasa.

La función de proteína puede ser modificada y mejorada in vitro por una variedad de métodos, incluyendo que la mutagénesis orientada al sitio (Alber et al., Nature, 5; 330 (6143) : 41-46, 1987) , clonación combinatoria (Huse et al., Science, 246: 1275-1281, 1989; Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) y mutagénesis aleatoria combinada con sistemas de selección apropiados (Barbas et al., PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992) .

El método de mutagénesis aleatoria junto con selección ha sido usado en varios casos para mejorar la función de proteína y existen dos estrategias diferentes. En primer lugar, la randomización de la secuencia del gen entero en combinación con la selección de una proteína variante (mutante) con las características deseadas, seguida por un nuevo ciclo de mutagénesis y selección aleatorias. Este método entonces puede ser repetido hasta que una variante de proteína sea encontrada la que sea considerada óptima (Schier R et al., J Mol. Biol. 1996, 263 (4) : 551-567) . Aquí, la vía tradicional de introducir las mutaciones es por error PCR prono (Leung et al., Technique, 1: 11-15, 1989) con una tasa de mutación de aproximadamente 0, 7 %. En segundo lugar, las regiones definidas del gen pueden ser mutagenizadas con plantillas elementales degeneradas, que permiten tasas de mutación hasta 100 % (Griffiths et al., EMBO. J, 13: 3245-3260, 1994; Yang et al., J Mol.

Biol. 254: 392-403, 1995) . Mientras más alta sea la tasa de mutación que se usa, más limitada será la región del gen que pueda ser sometida a las mutaciones.

La mutación aleatoria ha sido usada exhaustivamente en el campo de la ingeniería de anticuerpos. Los genes de anticuerpo formados in vivo pueden ser clonados in vitro (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250-1256, 1989) y las combinaciones aleatorias de los genes que codifican los genes variables pesados y ligeros pueden ser sometidas a selección (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) . Los fragmentos de anticuerpo funcionales seleccionados adicionalmente pueden ser mejorados usando mutagénesis aleatoria y ciclos adicionales de selección (Schier R et al., J Mol. Biol. 1996, 263 (4) : 551-567) .

La estrategia de mutagénesis aleatoria es seguida por selección. Las variantes con las características interesantes pueden ser seleccionadas y las regiones de ADN mutadas de variantes diferentes, cada una con las características interesantes, son combinadas en una secuencia de codificación (Yang et al., J Mol. Biol. 254: 392403, 1995) . Este es un proceso secuencial multipaso, y los efectos sinergísticos potenciales de las mutaciones diferentes en regiones diferentes pueden ser perdidos, ya que no son sometidas a selección en la combinación. Por lo tanto, estas dos estrategias no incluyen mutagénesis simultánea de regiones definidas y selección de una combinación de estas regiones. Otro proceso involucra el emparejamiento combinatorio de genes que pueden ser usados para mejorar, por ejemplo, la afinidad de anticuerpo (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) . Aquí, las tres regiones CDR en cada gen variable son fijadas y esta tecnología no permite combinar los segmentos de genes individuales en el gen para dominio variable, por ejemplo, incluyendo las regiones CDR, entre clones.

El concepto de ADN que combina (Stemmer, Nature 370: 389-391, 1994) utiliza la fragmentación aleatoria de ADN y el ensamblaje de fragmentos en una secuencia de codificación funcional. En este proceso es posible presentar las secuencias de ADN químicamente sintetizadas y de este modo dirigir la variación a lugares definidos en el gen cuya secuencia de ADN es conocida (Crameri et al., Biotechniques, 18: 194-196, 1995) . Stemmer y colaboradores desarrollaron este método in vitro, que reensambla el proceso que ocurre normalmente de la evolución de proteína en la naturaleza. El combinar el ADN se genera diversidad por recombinación, combinando las mutaciones útiles de genes individuales. Ha sido usado con éxito para la evolución artificial de proteínas diferentes, por ejemplo enzimas y citoquinas (Chang et al. Nature Biotech. 17, 793-797, 1999; Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4504 -4509, 1997; Christians et al. Nature Biotech.. 17, 259-264, 1999) . Los genes son fragmentados al azar usando DNasa I y luego vueltos a reunir por recombinación entre sí. El material de partida puede ser un gen solo (primero mutado usando error PCR prono al azar) o una secuencia homologa que ocurre naturalmente denominada familia al combinar. La hidrólisis de ADN DNasa I de forma preferencial en los sitios adyacentes a los nucleótidos de pirimidina, por tanto éste es una elección apropiada para la fragmentación aleatoria de ADN. Sin embargo, la actividad está en función de los iones de Mg o Mn, los iones Mg restringen el tamaño del fragmento hasta 50bp mientras que los iones Mn darán tamaños de fragmentos menores de 50bp. Por lo tanto, para tener todos los tamaños posibles para la recombinación el gen en cuestión tiene que ser tratado por lo menos dos veces con DNasa I en presencia de cualquiera de los dos iones diferentes, seguida por el retiro de estos mismos iones.

En teoría, es posible combinar ADN entre cualquiera de los clones. Sin embargo, si el gen combinado resultante es el ser funcional con respecto a la expresión y actividad, los clones a ser combinados preferentemente tienen que estar relacionados o aun idénticos con la excepción de un bajo nivel de las mutaciones aleatorias. K\La combinación de ADN entre clones genéticamente diferentes en general producirá genes no funcionales. Sin embargo, ha sido demostrado por la metodología de ITCHY que pueden ser creadas bibliotecas de fusión de interspecies entre fragmentos del E. coli y genes de transformilasa de ribonucleótido de glicinamida humana, que tienen identificación solamente al 50 % sobre el nivel de ADN (Ostermeier et al., Nat Biotechnol 17, 1205-9, 1999) .

Una recombinación exitosa de dos genes diferentes requiere la formación de moléculas de hetero dúplex. En algunos casos la familia que combina solamente forma homo dúplex dando como resultado una frecuencia baja de recombinación. Este problema ha sido dirigido usando ADN de una sola hebra digerido por DNasa I (Kikuchi et al. Gene 2000, 243, 133 -137) .

Un ADN de una sola hebra puede ser obtenido esencialmente de dos maneras diferentes. En primer lugar, por el uso de plantillas elementales bioestanadas en las reacciones PCR en combinación por ejemplo con microcolumnas de captura tipo Dynabeads (Dynal, Noruega) o AffiniTip Streptavidin (Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, USA) . En segundo lugar, utilizando bacteriófagos que pueden contener ADN de una sola hebra (virus y entidades relacionadas en Modern Microbiology, Principles y Applicacions pp.171 -192, Ed. E.A. Birge, Wm.

C. Brown Publishers 1992; Sambrook et al. Molecular Cloning, A laborator y manual 2nd edition. Cold Spring Habor Laborator y Press, 1989) .

La selección de enzimas con propiedades alteradas y mejoradas está a menudo basada en la función verdadera de la enzima. Por ejemplo la estabilidad térmica aumentada de una enzima puede ser seleccionada porque incubando las colonias transformadas a las temperaturas que causan la desactivación de enzimas de tipo natural y la actividad de 13-glucosidasa mejorada pueden ser identificadas usando PNPG como el sustrato (Arrizubieta et al, J Biol Chem, 27 de jun. 2000) .

La selección de proteínas funcionales de bibliotecas moleculares ha sido revolucionada por el desarrollo de la tecnología de muestra de fagos (Parmley et al., Gene, 73: 305-391, 1988; McCafferty et al., Nature, 348: 552-554, 1990; Barbas et al., PNAS. USA, 88: 7978-7982, 1991) . Aquí, el fenotipo (proteína) está directamente vinculada a su genotipo correspondiente (ADN) y esto permitirá directamente clonar del material genético que puede entonces ser sometido a modificaciones adicionales para mejorar la función de proteína. La muestra de Fago ha sido usada para clonar ligantes funcionales de una variedad de bibliotecas moleculares con hasta 1011 transformantes en el tamaño (Griffiths et al., EMBO. J. 13: 3245-3260, 1994) . Por lo tanto, la muestra de fago puede ser usada para clonar ligantes funcionales de bibliotecas moleculares directamente, y además también puede ser usada para mejorar los clones originalmente seleccionados. Otras clases de virus...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para generar una secuencia o una población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias de polinucleótidos madre de hebra sencilla que codifican uno o más motivos de proteína, que comprende los pasos de:

a) proporcionar ADN de hebra sencilla que constituye hebras de más y menos de las secuencias de polinucleótido madre;

b) digerir las secuencias de polinucleótidos de hebra sencilla con una exonucleasa para generar poblaciones de fragmentos de hebra sencillas;

c) poner en contacto dichos fragmentos generados de las hebras más con fragmentos generados de las hebras menos y opcionalmente, añadir las secuencias de plantilla que se fusionan a terminales 3' y 5' de al menos uno de los polinucleótidos madre en condiciones de fusión;

d) amplificar los fragmentos que se fusionan entre sí para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína teniendo características alteradas en comparación con el uno o más motivos de proteína codificados por dichos polinucleótidos madre.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la exonucleasa se selecciona entre el grupo que consta de BAL31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, y exonucleasa Rec Jf.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que la exonucleasa es BAL31.

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3 en el que una secuencia o unas secuencias de polinucleótidos madre han sido sometidas a mutagénesis.

5. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la población de fragmentos generados en el paso b) es sometida a mutagénesis.

6. Un método como se reivindica en la reivindicación 4 o 5, en el que la mutagénesis es PCR propenso a error.

7. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el paso b) es realizado para generar una población de fragmentos de una sola hebra de longitudes diferentes.

8. Un método como se reivindica en la reivindicación 7, en que el paso b) es controlado para generar una población de fragmentos de una sola hebra que tiene una longitud media de más de aproximadamente 50 nucleótidos.

9. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que adicionalmente comprende el paso de expresar al menos una secuencia de polinucleótidos generados en el paso d) para producir el polipéptido codificado.

10. Un método como se reivindica en la reivindicación 9 que adicionalmente comprende el paso de ensayar el polipéptido codificado para las características deseadas.

11. Un método como se reivindica en una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de polinucleótidos madre codifica un anticuerpo o fragmento del mismo.

12. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de polinucleótidos madre codifica una enzima.

13. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia de polinucleótidos madre codifica un antígeno.

14. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que adicionalmente comprende el paso de incorporar al menos una secuencia de polinucleótidos generada en el paso d) en un vector.

15. Un método como se reivindica en la reivindicación 14, que adicionalmente comprende el paso de expresar in vitro la al menos una secuencia de polinucleótidos incorporada en un vector para producir el polipéptido codificado.

16. Un método como se reivindica en la reivindicación 14 o 15, que adicionalmente comprende el paso de formular la secuencia o los vectores de polinucleótidos que comprenden el polinucleótido o el polipéptido codificado por el polinucleótido en una composición farmacéutica aceptable.

 

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