Un método para la evolución molecular in vitro de la función proteínica.

Un método para la generación de una secuencia o población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias de polinucleótidos madre,

el método comprendiendo los pasos de

(a) proporcionar una primera población de moléculas de polinucleótidos y una segunda población de moléculas de polinucleótidos, la primera y segunda población juntas constituyendo cadenas positivas y negativas de una molécula de polinucleótidos madre;

(b) digerir la primera y la segunda población de moléculas de polinucleótidos con una nucleasa para generar fragmentos de polinucleótidos;

(c) contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados de las cadenas positivas con fragmentos generados de las cadenas negativas (bajo condiciones que permiten la hibridación de fragmentos); y

(d) amplificar los fragmentos que hibridan entre si para generar al menos una molécula de polinucleótidos que difiere en secuencia de la molécula de polinucleótidos madre

en el que el grado de variabilidad de secuencia en una región seleccionada de la al menos una molécula de polinucleótidos producida en el paso (d) es controlado por la adición de uno o más oligonucleótidos de variabilidad predeterminada, cuyos oligonucleótidos hibridan a una secuencia que se encuentra entre, pero excluye, los nucleótidos terminales 3' y 5' de la molécula de polinucleótidos madre.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2006/004294.

Solicitante: ALLIGATOR BIOSCIENCE AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: SCHEELEVAGEN 19A 223 70 LUND SUECIA.

Inventor/es: FUREBRING, CHRISTINA, KARLSSON,FREDRIK, HARALDSSON,KARIN, KARLSSON,MARIE, HAGER,ANN-CHRISTIN MALMBORG, ELLMARK,PETER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/10 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

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Fragmento de la descripción:

0001 La presente invención se refiere a un método para la evolución molecular in vitro de la función proteínica que permite el control de la variabilidad introducida en regiones seleccionadas de una proteína matriz.

0002 La función proteínica puede ser modificada y mejorada in Vitro mediante una variedad de métodos, incluyendo mutagénesis dirigida al sitio (Alber et al., Nature, 5; 330 (6143) :41-46, 1987) clonación combinatoria (Huse et al., Science, 246: 1275-1281, 1989; Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) y mutagénesis aleatoria combinada con sistemas de selección apropiados (Barbas et al., PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992) .

0003 El método de mutagénesis aleatoria junto con la selección ha sido usado en una serie de casos para mejorar la función proteínica y existen dos estrategias diferentes. Primeramente, la asignación al azar de la secuencia genética completa en combinación con la selección de una proteína variante (mutante) con características deseadas, seguida por un una nueva ronda de mutagénesis aleatoria y selección. Este método puede luego repetirse hasta que se encuentre una variante de la proteína que es considerada óptima (Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4) : 551567) . Aquí, la vía tradicional para introducir mutaciones es por PCR propenso a error (Leung et al., Technique, 1: 1115, 1989) con una tasa de mutación de aproximadamente 0.7%. En segundo lugar, regiones definidas del gen pueden ser mutagenizadas con cebadores degenerados, lo que permite tasas de mutación de hasta el 100% (Griffiths et al., EMBO. J, 13: 3245-3260, 1994; Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995) .

0004 La mutación aleatoria ha sido usada extensamente en el campo de ingeniería de anticuerpos. Genes de anticuerpos formados in vivo pueden clonarse in vitro (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 12501256, 1989) y combinaciones aleatorios de los genes que codifican los genes variables pesados y ligeros pueden estar sujetas a selección (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) . Fragmentos funcionales de anticuerpos seleccionados por estos métodos pueden ser además mejorados utilizando mutagénesis aleatoria y rondas adicionales de selecciones (Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4) : 551-567) .

0005 Normalmente, la estrategia de la mutagénesis aleatoria es seguida por selección. Pueden seleccionarse variantes con características interesantes y las regiones de ADN mutadas de diferentes variantes, cada una con características interesantes, combinarse en una secuencia de codificación (Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995) .

0006 El emparejamiento combinatorio de los genes ha sido también usado para mejorar la función proteínica, ej., afinidad de anticuerpo (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992) .

0007 Otro proceso conocido para la mutación in vitro de la función proteínica, que se refiere a menudo como “transposición de ADN”, utiliza la fragmentación aleatoria del ADN y el ensamblaje de los fragmentos en una secuencia de codificación funcional (Stemmer, Nature 370: 389-391, 1994) . El proceso de transposición de ADN genera diversidad mediante la recombinación, combinando mutaciones útiles de genes individuales. Ha sido usado satisfactoriamente para evolución artificial de diferentes proteínas, ej., enzimas y citocinas (Chang et al., Nature Biotech. 17, 793.797, 1999; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4504-4509, 1997; Christians et al., Nature Biotech. 17, 259-264, 1999) . Los genes son fragmentados aleatoriamente utilizando DNasa I y luego reensamblado mediante recombinación entre sí. El material de partida puede ser un solo gen (primero mutado aleatoriamente usando PCR propenso a error) o secuencias homologas en forma natural (llamado transposición familiar) .

0008 La DNasa I hidroliza al ADN de forma preferencial en lugares adyacentes a los nucleótidos de pirimidina, por lo tanto es una elección adecuada para la fragmentación aleatoria del ADN. Sin embargo, la actividad depende de iones Mg o Mn, los iones Mg restringen el tamaño del fragmento a 50bp, mientras que los iones Mn darán tamaños de fragmento menores que 50bp. Por tanto, con el fin de tener todos los tamaños posibles para la recombinación, el gen en cuestión necesita tratarse al menos dos veces con DNasa I en presencia de cualquiera de los dos iones diferentes, seguido por la eliminación de estos mismos iones.

0009 Aunque, en teoría, es posible transponer el ADN entre los clones, si el gen traspuesto resultante debe ser funcional con respecto a expresión y actividad, los clones a transponer tienen preferentemente que estar relacionados o incluso ser idénticos, con excepción de un bajo nivel de mutaciones aleatorias. La transposición de ADN entre clones genéticamente diferentes producirá generalmente genes no funcionales.

0010 La presente invención busca proporcionar métodos mejorados para la evolución de proteínas in vitro. En particular, la invención tiene como objetivo proporcionar un método que permita controlar el grado de variabilidad introducida en regiones seleccionadas de una secuencia de polinucleótidos madre.

0011 Así, según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la generación de una molécula polinucleótida variante, o la población de la misma, de una molécula de polinucleótido madre, el método comprendiendo los pasos de

(a) proporcionar una primera población de moléculas de polinucleótidos y una segunda población de moléculas de polinucleótidos, la primera y la segunda población juntas constituyendo cadenas positiva y negativa de una molécula de polinucleótido madre;

(b) asimilar la primera y la segunda población de moléculas de polinucleótidos con una nucleasa para generar fragmentos de polinucleótidos;

(c) contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados de las cadenas positivas con fragmentos generados de las cadenas negativas (bajo condiciones que permiten la hibridación de fragmentos) ; y

(d) amplificar los fragmentos que hibridan entre si para generar al menos una molécula de polinucleótido que difiere en secuencia de la molécula de polinucleótido madre

donde el grado de variabilidad de secuencia en una región seleccionada de al menos una molécula de polinucleótido producida en el paso (d) es controlada mediante la adición de uno o más oligonucleótidos de variabilidad predeterminada, cuyos oligonucleótidos que hibridan con una secuencia que se encuentra entre, pero excluye, los nucleótidos terminales 3’ y 5’ de la molécula de polinucleótido madre.

0012 Una ventaja clave proporcionada por los métodos de la presente invención es que permiten el control del grado de la variabilidad de secuencia introducida en las secuencias de polinucleótido madre, mediante la adición de uno o más oligonucleótidos de variabilidad predeterminada. Esos oligonucleótidos son capaces de hibridarse (preferiblemente bajo condiciones de alta severidad) a una secuencia interna objetivo presente en una o más de las secuencias de polinucleótido madre.

0013 Los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son capaces de hibridar a una secuencia interna que se encuentra entre, pero excluye, el nucleótido terminal 3’ o 5’ de la molécula de polinucleótido madre (de modo que los oligonucleótidos no son capaces de hibridar a los nucleótidos terminales 3’ o 5’) . Por ello, el término ‘oligonucleótidos de variabilidad predeterminada’ no pretende abarcar las secuencias iniciadoras finales o un molde de longitud

completa. Sin embargo, se apreciará que el paso (c) adicionalmente puede comprender la adición de secuencias iniciadoras que hibridan a los extremos 3’ y/o 5’ de al menos uno de los polinucleótidos madre bajo condiciones de hibridación.

0014 En una realización preferida del método de la invención, donde la primera y la segunda población de polinucleótidos son de cadena simple, los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son agregados antes de o en el paso (b) y la nucleasa utilizada para digerir los polinucleótidos madre es especifica para polinucleótidos de cadena simple (por ejemplo, nucleasa S1, Exo I, Exo T y nucleasa de judía Mung) . Cuando se añade así, los oligonucleótidos anillan/hibridan a la primera y segunda población de polinucleótidos madre de cadena simple, produciendo de este modo regiones de doble cadena que están protegidas de la digestión de la nucleasa especifica de cadena simple (ver Figura 2) . Consecuentemente, la variabilidad dentro de esta secuencia protegida es controlada en los polinucleótidos variantes resultantes producidos en el paso... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para la generación de una secuencia o población de secuencias de polinucleótidos a partir de secuencias de polinucleótidos madre, el método comprendiendo los pasos de

(a) proporcionar una primera población de moléculas de polinucleótidos y una segunda población de moléculas de polinucleótidos, la primera y segunda población juntas constituyendo cadenas positivas y negativas de una molécula de polinucleótidos madre;

(b) digerir la primera y la segunda población de moléculas de polinucleótidos con una nucleasa para generar fragmentos de polinucleótidos;

(c) contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados de las cadenas positivas con fragmentos generados de las cadenas negativas (bajo condiciones que permiten la hibridación de fragmentos) ; y

(d) amplificar los fragmentos que hibridan entre si para generar al menos una molécula de polinucleótidos que difiere en secuencia de la molécula de polinucleótidos madre

en el que el grado de variabilidad de secuencia en una región seleccionada de la al menos una molécula de polinucleótidos producida en el paso (d) es controlado por la adición de uno o más oligonucleótidos de variabilidad predeterminada, cuyos oligonucleótidos hibridan a una secuencia que se encuentra entre, pero excluye, los nucleótidos terminales 3’ y 5’ de la molécula de polinucleótidos madre.

2. Un método según la Reivindicación 1 donde los polinucleótidos madre codifican uno o más motivos de proteína.

3. Un método según la Reivindicación 1 o 2 donde la primera y la segunda población de polinucleótidos son ADNc.

4. Un método según la Reivindicación 1, 2 o 3 donde la primera y la segunda población de polinucleótidos son de cadena simple.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera población de polinucleótidos consiste de cadenas positivas de secuencias de polinucleótidos madre y la segunda población de polinucleótidos consiste de cadenas negativas de secuencias de polinucleótidos madre.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera y la segunda población de polinucleótidos son digeridas separadamente en el paso (b) .

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la nucleasa en el paso (b) es una exonucleasa.

8. Un método según la Reivindicación 7 donde la exonucleasa es seleccionada del grupo que consiste de BAL31, exonucleasa I, exonucleasa VII, exonucleasa T7 gen 6, bacteriófago lambda exonucleasa y exonucleasa Rec Jf.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la secuencia de aminoácido alterada de la al menos una secuencia de polinucleótidos producida en el paso (d) es asociada con una propiedad alterada del polipéptido codificado.

10. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 9 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son añadidos antes de o en el paso (b) y donde la nucleasa es especifica para polinucleótidos de cadena simple.

11. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son añadidos después del paso (b) y antes de o en el paso (c) .

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia interna de una secuencia de polinucleótidos madre, por ejemplo al menos 95%, 96%, 97%, 98% 99% o 100% de identidad de secuencia.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten 100% de identidad de secuencia con la secuencia interna de una secuencia de polinucleótidos madre.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son de una secuencia de nucleótido única.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son de al menos dos secuencias diferentes.

16. Un método según la Reivindicación 15 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son variantes de la misma secuencia interna de una secuencia de polinucleótidos madre.

17. Un método según la Reivindicación 15 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten 100% de identidad de secuencia con, o son variantes de, al menos dos regiones diferentes de los polinucleótidos madre.

18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son producidos por PCR propenso a error o usando un sintetizador de oligonucleótidos.

19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son de entre 10 y 500 nucleótidos de longitud.

20. Un método según la Reivindicación 19 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada son de entre 50 y 200 nucleótidos de longitud.

21. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 20 donde las secuencias de polinucleótidos madre codifican un ligando.

22. Un método según la Reivindicación 21 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten identidad de secuencia con, o son variantes de, una región de las secuencias de polinucleótidos madre que codifican una secuencia de aminoácido que interactúa, directa o indirectamente, con una molécula biológica.

23. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 20 donde las secuencias de polinucleótidos madre codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

24. Un método según la Reivindicación 23 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten identidad de secuencia con, o son variantes de, una región de las secuencias de polinucleótidos madre, que codifica un polipéptido marco.

25. Un método según la Reivindicación 23 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten identidad de secuencia con, o son variantes de, una región de las secuencias de polinucleótidos madre que codifican un CDR.

26. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 20 donde las secuencias de polinucleótidos madre codifican un enzima o fragmento catalíticamente activo del mismo.

27. Un método según la Reivindicación 26 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten identidad de secuencia con, o son variantes de, una región de las secuencias de polinucleótidos madre que codifican un sitio activo, un sitio modulador o una región implicada en la estabilidad del enzima.

28. Un método según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 20 donde las secuencias de polinucleótidos madre codifican un antigeno.

29. Un método según la Reivindicación 28 donde los oligonucleótidos de variabilidad predeterminada comparten identidad de secuencia con, o son variantes de, una región de las secuencias de polinucleótidos madre que codifican un epítopo.

30. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el paso (c) comprende además añadir secuencias de cebadores que hibridan a los extremos 3’ y/o 5’ de al menos uno de los polinucleótidos madre bajo condiciones de hibridación.

31. Un método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 30 donde, en el paso (b) , al menos un parámetro de la reacción usada para la digestión de la primera población de moléculas de polinucleótidos es diferente del (de los) parámetro (s) equivalente (s) usado (s) en la reacción para la digestión de la segunda población de moléculas de polinucleótidos.

32. Un método según la Reivindicación 31 donde el parámetro de reacción es seleccionado de tipo de nucleasa, concentración de nucleasa, volumen de reacción, duración de la reacción de digestión, temperatura de la mezcla de reacción, pH de la mezcla de reacción, longitud de las secuencias de polinucleótidos madre, la cantidad de moléculas de polinucleótidos madre y la composición de tampón de la mezcla de reacción.

33. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde las secuencias de polinucleótidos madre han sido sometido a mutagénesis.

34. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde una o ambas de las poblaciones de fragmentos generados en el paso (b) es sometida a mutagénesis.

35. Un método según la Reivindicación 33 o 34 donde la mutagénesis es PCR propenso a error.

36. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el paso (b) es llevado a cabo para generar poblaciones de fragmentos de cadena simple de longitudes variantes.

37. Un método según la Reivindicación 36 en el que el paso (b) es controlado para generar una población de fragmentos de cadena simple con una longitud promedio de más de 50 nucleótidos aproximadamente.

38. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además el paso de expresar al menos una secuencia de polinucleótidos generada en el paso (d) para producir el polipéptido codificado.

39. Un método según la Reivindicación 28 que comprende además el paso de ensayar el polipéptido en cuanto a características alteradas.

40. Un método para hacer un polipéptido con propiedades alteradas, el método comprendiendo los siguientes pasos:

(a) generar formas variantes de un polinucleótido madre usando un método según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 39;

(b) expresar los polinucleótidos variantes producidos el paso (a) para producir polipéptidos variantes;

(c) detectar los polipéptidos variantes para propiedades alteradas; y

(e) seleccionar un polipéptido con propiedades alteradas de los polipéptidos variantes.


 

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