Una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:

1, excepto que la secuencia de aminoácidos contiene entre una y veinte mutaciones, en la que cada mutación implica un único aminoácido y en la que la mutación o mutaciones reducen o eliminan la actividad ADP-ribosilante de la proteína.

Toxinas bacterianas ADP-ribosilantes

Campo técnico

La presente invención está en el campo de las toxinas bacterianas ADP-ribosilantes y sus usos.

Técnica anterior Las exotoxinas bacterianas ADP-ribosilantes son ampliamente conocidas. Ejemplos incluyen toxina diftérica (Cor y nebacterium diphtheriae) , exotoxina A (Pseudomonas aeruginosa) , toxina colérica (CT; Vibrio cholerae) , enterotoxina lábil al calor (LT; E. coli) y toxina pertussis (PT) .

Las toxinas catalizan la transferencia de una unidad de ADP-ribosa de NAD+ a una proteína diana. CT, por ejemplo, transfiere ADP-ribosa a una cadena lateral de arginina específica de una subunidad de GS, que bloquea la capacidad de GS para hidrolizar GTP a GDP. Esto cierra la proteína en su forma 'activa', por lo que la actividad de la adenilato ciclasa está permanentemente activada. Los niveles de cAMP celular aumentan, conduciendo al transporte activo de iones de la célula y la pérdida de agua en el intestino [1].

Las toxinas se dividen normalmente en dos dominios funcionalmente distintos - A y B. La subunidad A es responsable de la actividad enzimática tóxica, mientras que la subunidad B es responsable de la unión celular. Las subunidades podrían ser dominios en la misma cadena de polipéptidos, o podrían ser cadenas de polipéptidos separadas. Las subunidades pueden por sí mismas ser oligómeros, por ejemplo, la subunidad A de CT consiste en A1 y A2 que están ligadas por un enlace disulfuro, y su subunidad B es un homopentámero. Normalmente, el contacto inicial con una célula diana está mediado por la subunidad B y luego la subunidad A sola entra en la célula.

Se conocen estructuras cristalinas [2] para LT [3], CT [4] y PT [5].

Las toxinas son normalmente inmunogénicas, y se han propuesto para su uso en vacunas acelulares. Un problema, sin embargo, es que las proteínas retienen su actividad tóxica en las vacunas. Para evitar este problema, la mutagénesis dirigida a sitio de residuos de sitio activo claves se ha usado para eliminar actividad enzimática tóxica, a la vez que se retiene la inmunogenicidad [por ejemplo refs. 6 (CT y LT) , 7 (PT) , 8 etc.]. Las actuales vacunas contra la tos ferina acelulares incluyen una forma de toxina pertussis con dos sustituciones de aminoácidos (Arg9-Lys y Glu129-Gly; 'PT-9K/129G' [9]) .

Además de sus propiedades inmunogénicas, las toxinas se han usado como adyuvantes. La adyuvanticidad parenteral se observó por primera vez en 1972 [10] y la adyuvanticidad mucosa en 1984 [11]. Se encontró sorprendentemente en 1993 que las formas desintoxicadas de las toxinas retienen la adyuvanticidad [12].

Es un objeto de la invención proporcionar más toxinas bacterianas ADP-ribosilantes.

Divulgación de la invención Las secuencias de aminoácidos de seis toxinas ADP-ribosilantes diferentes de bacterias Gram-positivas y Gramnegativas se facilitan en SEC ID 1, 3, 4, 5, 6 y 7. Estas toxinas son de Neisseria meningitidis, Streptomyces coelicolor, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi y Streptococcus pyogenes. La existencia de toxinas ADP-ribosilantes en estas especies bacterianas no se ha sugerido previamente y, además, sólo hay un bajo nivel de identidad de secuencias entre estas toxinas y toxinas tales como CT, LT y PT.

Toxinas mutantes de la invención Toxinas mutantes de la invención La invención proporciona una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID 1, excepto que la secuencia de aminoácidos contiene entre una y veinte mutación (mutaciones) , en la que cada mutación implica un único aminoácido y en la que la mutación (mutaciones) reduce (n) o elimina (n) actividad ADP-ribosilante de la proteína.

Las mutaciones pueden ser cada una independientemente una sustitución, una inserción o una deleción. Las secuencias de aminoácidos contienen menos de veinte mutaciones (por ejemplo, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1) .

Las mutaciones preferidas son sustituciones de un único aminoácido (por ejemplo, SEC ID 10, 12, 14 y 16) .

La invención también proporciona un procedimiento para disminuir la actividad ADP-ribosilante enzimática de una toxina de la invención, que comprende mutar uno o más residuos de aminoácidos de dicha toxina. Esto puede lograrse convenientemente realizando mutagénesis dirigida a sitio en el ácido nucleico que codifica la toxina. La invención proporciona además una proteína que puede obtenerse por este procedimiento.

Las mutaciones también pueden introducirse para mejorar la estabilidad, por ejemplo, la inserción de enlaces disulfuro [13].

Las proteínas definidas anteriormente se denominan más adelante en este documento "toxinas mutantes de la invención" o "toxoides de la invención".

Los sitios preferidos para la mutación se facilitan en la Tabla 1, junto con mutaciones preferidas en esos sitios.

Proteínas de la invención La invención proporciona una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de una toxina mutante de la invención.

La divulgación también proporciona una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de una toxina mutante de la invención. El grado de identidad de secuencias es preferentemente superior al 50% (por ejemplo, el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, el 99% o más) . Estas proteínas incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. Normalmente, el 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera que es una indicación de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se determina preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de huecos afín con los parámetros penalidad abierta por huecos=12 y penalidad por extensión de huecos=1.

Las toxinas y proteínas mutantes definidas anteriormente se denominan en conjunto más adelante en este documento las "proteínas de la invención".

Las proteínas de la invención pueden, por supuesto, prepararse por diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir de huésped nativo, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, nativa, fusiones etc.) . Se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libre de proteínas de célula huésped) .

La invención también proporciona las proteínas de la invención (particularmente las toxinas mutantes) para su uso como adyuvantes y, en particular, como adyuvantes de la mucosa.

La invención también proporciona el uso de las proteínas de la invención en la preparación de un medicamento para producir una respuesta inmunitaria en un animal. El medicamento es preferentemente una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) y comprenderá, además de una proteína de la invención, un antígeno contra el que va a producirse una respuesta inmunitaria. El medicamento se administra preferentemente mucosalmente, por ejemplo, por vía oral o intranasalmente.

La invención también proporciona composiciones inmunogénicas (por ejemplo, una vacuna) que comprenden una proteína de la invención en mezcla con un segundo antígeno. También proporciona un kit que comprende una proteína de la invención y un segundo antígeno para administración simultánea, separada o secuencial. El segundo antígeno es preferentemente uno de las proteínas de N. meningitidis desveladas en las referencias 14 a 20. La composición puede comprender un tercer antígeno, un cuarto antígeno, un quinto antígeno, etc., uno o más de los cuales puede seleccionarse de las proteínas de N. meningitidis desveladas en estas siete referencias.

Según otro aspecto, la invención proporciona anticuerpo que se une a una proteína de la invención. Éstos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse por cualquier medio adecuado. El anticuerpo puede incluir una marca detectable.

Según otro aspecto, la invención proporciona ácido nucleico que codifica las proteínas de la invención. Éste puede usarse en reacciones de hibridación (por ejemplo, transferencias Northern o Southern, o en micromatrices de ácido nucleico o 'chips de genes') y reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, NASBA, TMA) , etc.

La invención también proporciona ácido nucleico... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1, excepto que la secuencia de aminoácidos contiene entre una y veinte mutaciones, en la que cada mutación implica un único aminoácido y en la que la mutación o mutaciones reducen o eliminan la actividad ADP-ribosilante de la proteína.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que cada mutación es independientemente una sustitución, una inserción

o una deleción.

3. La proteína de la reivindicación 2, en la que cada mutación es una sustitución o una deleción.

4. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína comprende una o más de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1.

5. La proteína de la reivindicación 4, que consiste en SEC ID Nº: 10, 12, 14 ó 16.

6. Una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un adyuvante.

8. La proteína de la reivindicación 7 para su uso como un adyuvante de la mucosa.

9. Una composición inmunogénica que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en mezcla con un antígeno.

10. Anticuerpo que se une a la proteína de la reivindicación 3.

11. Ácido nucleico que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 12.

14. Una composición que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el anticuerpo de la reivindicación 10 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 11.

15. Una composición que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 11 para su uso como un adyuvante.

16. Uso de la composición de la reivindicación 15 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir infección bacteriana.

17. El uso de la reivindicación 16, en el que la infección bacteriana es producida por Neisseria meningitidis.

18. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 para su uso como un adyuvante.

19. Un anticuerpo que se une a la proteína de SEC ID Nº: 1 para su uso como un medicamento.

20. Una composición que comprende la proteína de la reivindicación 18 y/o el anticuerpo de la reivindicación 19 para su uso como un adyuvante.

21. Una composición inmunogénica que comprende una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 en mezcla con un antígeno.

22. Ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID 11, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26.