Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta en o asociada con el recipiente,

conteniendo el recipiente una composición que comprende como agente activo un anticuerpo humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor de la Kd no superior a 1 x 10-8 y/o tiene un valor DE50 no superior a 5 nM para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones marco consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana como se muestra en la SEQ ID NO: 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ ID NO: 117), en el que X1 es D, T o E, X2 es F, W o Y, X3 es T, Q, G o S,

X4 es H o N y X5 es M o I;

CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118), en el que X1 es Y o W; y

CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO: 119), en el que X1 es H o Y, X2 es Y, R, K, I, T, E o W, X3 es

G, N, A, D, Q, E, T, K o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E o G y X5 es S o G; y que tiene un dominio variable de la cadena ligera que comprende las regiones marco consenso del subgrupo I de la cadena ligera kappa que se muestra en la SEQ ID NO: 12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID NO: 121), en el que X1 es R o S, X2 es S o N, X3 es Q o E, X4 es Q o D

y X5 es I o L;

CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 122);

CDRL3: QQYSX1X2PWT (SEQ ID NO: 123), en el que X1 es T, A o N y X2 es V o T,

en las que en comparación con la SEQ ID NO: 11, el dominio variable de la cadena pesada tiene una sustitución en uno cualquiera o más de los siguientes restos de las regiones marco consenso: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y en las que en comparación con la SEQ ID NO: 12, el dominio variable de la cadena ligera tiene bien una sustitución en, y solo en, el resto 46L de las regiones marco consenso o bien tiene sustituciones en los restos 4L y 46L de las regiones marco consenso,

en las que la numeración de los restos es como se muestra en la Fig. 1

Recipiente que contiene anticuerpos dirigidos contra VEGF.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente a anticuerpos dirigidos contra VEGF y, en particular, a anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF.

Descripción de la técnica relacionada [0002] Es bien sabido en la actualidad que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos. Entre estos se incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , artritis reumatoide, y psoriasis (Folkman y col. J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 (1992) ; Klagsbrun y col. Annu. Rev. Physiol. 53: 217-239 (1991) ; y Garner A, Vascular diseases. En: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2ª Edición Marcel Dekker, NY, pp. 1625-1710 (1994) ) . En el caso de tumores sólidos, la neovascularización permite a las células tumorales adquirir una ventaja de crecimiento y una autonomía proliferativa en comparación con las células normales. De acuerdo con esto, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama así como en algunos otros tumores (Weidner y col. N Engl J Med 324: 1-6 (1991) ; Horak y col. Lancet 340: 1120-1124 (1992) ; y Macchiarini y col. Lancet

340: 145-146 (1992) ) .

La investigación de reguladores positivos de la angiogénesis ha dado como resultado muchos candidatos, incluyendo aFGF, bFGF, TGF-a, TNF-º, HGF, TNF-a, angiogenina, IL-8, etc., (Folkman y col. y Klagsbrun y col) . Los reguladores negativos identificados hasta el momento incluyen trombospondina (Good y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 6624-6628 (1990) ) , el fragmento en el extremo N de 16 kilodalton de la prolactina (Clapp y col. Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993) ) , angiostatina (O'Reilly y col. Cell, 79: 315-328 (1994) ) y endostatina (O'Reilly y col. Cell, 88: 277-285 (1996) ) .

El trabajo llevado a cabo en los últimos años ha establecido el papel clave del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la regulación de la angiogénesis normal y anormal (Ferrara y col. Endocr. Rev. 18: 425 (1997) ) . El hallazgo de que la pérdida de incluso un único alelo de VEGF da como resultado letalidad embriónica apunta a un papel irremplazable jugado por este factor en el desarrollo y la diferenciación de sistema vascular (Ferrara y col.) . Además, VEGF ha demostrado ser un mediador clave de la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara y col.) . El ARNm de VEGF se expresa en exceso en la mayoría de tumores humanos examinados (Berkman y col. J Clin Invest 91: 153-159 (1993) ; Brown y col. Human Pathol. 26: 8691 (1995) ; Brown y col. Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993) ; Mattern y col. Brit. J. Cancer. 73: 931-934 (1996) ; y Dvorak y col. Am J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995) ) . También, la concentración de VEGF en fluidos oculares está muy correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia (Aiello y col. N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994) ) . Además, recientes estudios han demostrado la localización de VEGF en las membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD (Lopez y col. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37: 855-868 (1996) ) . Los Anticuerpos neutralizantes dirigidos contra VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas de células tumorales humanas en ratones sin pelo (Kim y col. Nature 362: 841-844 (1993) ; Warren y col. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995) ; Borgström y col. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996) ; y Melnyk y col. Cancer Res. 56: 921-924 (1996) ) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquémicos (Adamis y col. Arch. Ophthalmol. 114: 66-71 (1996) ) . Por tanto, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y diversos trastornos neovasculares intraoculares.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona artículos de fabricación que comprenden anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF y variantes de anticuerpos dirigidos contra VEGF con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, que incluyen una fuerte afinidad de unión por VEGF; la capacidad de inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro; y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vivo.

Los anticuerpos humanizados dirigidos contra VEGF o las variantes de anticuerpos dirigidos contra VEGF preferidos en la presente memoria descriptiva se unen a VEGF humano con un valor Kd no superior a aproximadamente 1 x 10-8 M y preferiblemente no más de aproximadamente 5 x 10-9 M. Adicionalmente, el anticuerpo humanizado o la variante dirigida contra VEGF puede tener un valor DE50 no superior a aproximadamente 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de las células endoteliales in vitro Los anticuerpos humanizados o las variantes dirigidas contra VEGF de particular interés en la presente memoria descriptiva son aquellos que inhiben al menos aproximadamente un 50 % del crecimiento tumoral en un modelo de tumor A673 in vivo, a una dosis de anticuerpo de 5 mg/kg.

En una realización, el anticuerpo dirigido contra VEGF tiene un dominio variable de la cadena pesada y ligera, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos CDRH1 (GYX1FTX2YGMN, en la que X1 es T o D y X2 es N o H; SEQ ID NO: 128) , CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID NO: 2) y CDRH3 (YPX1YYGX2SHWYFDV, en la que X1 es Y o H y X2 es S o T; SEQ ID NO: 129) . Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada puede comprender las secuencias de aminoácidos de CDRH1 (GYTFTNYGMN; SEQ ID NO: 1) , CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEQ ID NO: 2) y CDRH3 (YPHYYGSSHWYFDV; SEQ ID NO: 3) . Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena pesada se proporcionan en una región marco humana, por ejemplo como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula FR1-CDRH1-FR2-FR3-CDRH3-FR4.

Un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo dirigido contra VEGF preferido comprende la secuencia de aminoácidos EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWI NTYTGEPTYAADFKRRTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YYGX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 125) , en la que X1 es T o D, X2 es N o H; X3 es Y o H and X4 es S o T. Una secuencia de dominio variable de la cadena pesada particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F (ab) -12 del Ejemplo I y comprende el dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7. Dichas secuencias preferidas del dominio variable de la cadena pesada se pueden combinar con las siguientes secuencias preferidas del dominio variable de la cadena ligera o con otras secuencias del dominio variable de la cadena ligera, con la condición de que el anticuerpo producido de esta manera se una el VEGF humano y cumpla los requerimientos de las reivindicaciones.

Las secuencias preferidas del dominio variable de la cadena ligera se pueden combinar con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada anteriormente identificadas o con otras secuencias del dominio variable de la cadena pesada, con la condición de que el anticuerpo producido de esta manera retenga la capacidad de unirse a un VEGF humano y cumpla los requerimientos de las reivindicaciones. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena ligera puede comprender regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRL1 (SASQDISNYLN; SEQ ID NO: 4) , CDRL2 (FTSSLHS; SEQ ID NO: 5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEQ ID NO: 6) . Preferiblemente, se proporcionan las tres regiones hipervariables de la cadena ligera en una región marco humana, por ejemplo, como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRL1-FR2CDRL2-FR3-CDRL3-FR4.

En una realización, la invención incorpora un dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo humanizado dirigido contra VEGF que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIQX1TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 124) , en la que X1 es M

o L. Una secuencia de dominio variable de la cadena ligera particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F (ab) -12 del Ejemplo... [Seguir leyendo]

1. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta en o asociada con el recipiente, conteniendo el recipiente una composición que comprende como agente activo un anticuerpo humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor de la Kd no superior a 1 x 10-8 y/o tiene un valor DE50 no superior a 5 nM para inhibir la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones marco consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana como se muestra en la SEQ ID NO: 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ ID NO: 117) , en el que X1 es D, T o E, X2 es F, W o Y, X3 es T, Q, G o S, X4 es H o N y X5 es M o I;

CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118) , en el que X1 es Y o W; y CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO: 119) , en el que X1 es H o Y, X2 es Y, R, K, I, T, E o W, X3 es G, N, A, D, Q, E, T, K o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E o G y X5 es S o G; y que tiene un dominio variable de la cadena ligera que comprende las regiones marco consenso del subgrupo I de la cadena ligera kappa que se muestra en la SEQ ID NO: 12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1: X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID NO: 121) , en el que X1 es R o S, X2 es S o N, X3 es Q o E, X4 es Q o D

y X5 es I o L;

CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 122) ;

CDRL3: QQYSX1X2PWT (SEQ ID NO: 123) , en el que X1 es T, A o N y X2 es V o T, en las que en comparación con la SEQ ID NO: 11, el dominio variable de la cadena pesada tiene una sustitución en uno cualquiera o más de los siguientes restos de las regiones marco consenso: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y en las que en comparación con la SEQ ID NO: 12, el dominio variable de la cadena ligera tiene bien una sustitución en, y solo en, el resto 46L de las regiones marco consenso o bien tiene sustituciones en los restos 4L y 46L de las regiones marco consenso, en las que la numeración de los restos es como se muestra en la Fig. 1

2. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena ligera tiene una sustitución en, y solo en, el resto 46L de las regiones marco consenso.

3. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en al menos dos de dichos restos de la cadena pesada.

4. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en al menos tres de dichos restos de la cadena pesada.

5. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en al menos cuatro de dichos restos de la cadena pesada.

6. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo tiene sustituciones en los restos 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H y 94H.

7. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que: en CDRH1, X1 es D o T, X2 es F, X3 es T yX5 es M; en CDRH2, X1 es Y; y en CDRH3, X2 es Y, X3 es G, X4 es S o T y X5 es S.

8. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que: en CDRL1, X1 es S, X2 es S, X3 es Q, X4 es D y X5 es I; y en CDRL3, X1 es T y X2 es V.

9. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos:

"CDR7" : X1SX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ID NO: 120) , en la que X1 es F, I, V, L o A, X2 es A, L, V o I, X3 es T, V o K, X4 es S o W, X5 es S o K, X6 es N o S y X7 es V, A, L o I.

10. El artículo d fabricación de acuerdo con la reivindicación 9, en el que en CDR7, X1 es F, X2 es L, X3 es T, X4 es S, X5 es K, X6 es S y X7 es A.

11. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 8.

12. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 8

13. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 116 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 115.

14. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 116 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 115.

15. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con un valor de la Kd no superior a aproximadamente 1 x10-8 M.

16. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 15 en el que el anticuerpo se une al VEGF humano con un valor de la Kd no superior a aproximadamente 5 x 10-9 M.

17. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

18. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el anticuerpo es una IgG humana.

19. El artículo de fabricación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

20. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el anticuerpo es un Fab.

21. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la etiqueta indica que la composición se usa en un procedimiento de tratamiento médico.

22. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etiqueta indica que la composición se usa para tratar un tumor.

23. El artículo de fabricación de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la etiqueta indica que la composición se usa para tratar un trastorno de la retina.

24. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente es una botella, vial o jeringuilla.

25. El artículo de fabricación de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente está formado a partir de vidrio o plástico.