Reactivos y procedimientos para la detección por desactivación de la fluorescencia.

Un conjugado de oligonucleótido que tiene la fórmula

FL-ODN-Q

en la que ODN es un oligonucleótido o ácido nucleico;

FL es un resto fluoróforo unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, y

Q es un resto desactivador unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo el resto desactivador la estructura **Fórmula**

en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O(CH2)nCH3, -(CH2)nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[(CH2)n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o -(CH2)n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y en la que el resto desactivador se une al enlazador a través del enlace de valencia designado a.

Reactivos y procedimientos para la detección por desactivación de la fluorescencia Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La invención se refiere a conjugados de oligonucleótido-desactivador-colorante-fluorescente que tienen características mejoradas, y a reactivos adecuados para incorporar restos de colorantes fluorescentes y desactivadores novedosos en oligonucleótidos. La invención también se refiere al uso de conjugados de oligonucleótido-desactivador-colorante-fluorescente en procedimientos de detección para dianas de ácidos nucleicos.

2. Breve descripción de la técnica relacionada Los oligonucleótidos sintéticos se han usado durante años como sondas específicas de secuencia para dianas de ARN y ADN complementarios. Estos procedimientos tienen una amplia aplicación en estudios forenses, biología molecular y diagnóstico médico, ya que permiten la identificación y cuantificación de dianas de ácidos nucleicos específicos. Los primeros usos de sondas de ADN se basaron en la radiactividad (normalmente 32P) como marcador, mientras que los últimos usan moléculas indicadoras que incluyen grupos quimioluminiscentes y fluorescentes. La mejora en la instrumentación ha permitido que la sensibilidad de estos procedimientos espectroscópicos se acerque o supere a los procedimientos de radiomarcado. Los procedimientos de detección desarrollados recientemente emplean el procedimiento de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para la detección de la hibridación de sonda en lugar de la detección directa de la intensidad de fluorescencia. En este tipo de ensayo, se produce la FRET entre un fluoróforo dador (indicador) y una molécula aceptora (desactivador) cuando el espectro de absorción de la molécula desactivadora se solapa con el espectro de emisión del fluoróforo dador y las dos moléculas están muy próximas. La energía del estado excitado del fluoróforo dador se transfiere al aceptor vecino por la interacción dipolo-dipolo inducido de resonancia, lo que da como resultado la desactivación de la fluorescencia del dador. Si la molécula aceptora es un fluoróforo, algunas veces se puede incrementar su fluorescencia. La eficacia de la transferencia de energía entre las moléculas de dador y aceptor es altamente dependiente de la distancia entre las moléculas. Las ecuaciones que describen esta relación se conocen. La distancia Forster (Ro) se describe como la distancia entre las moléculas de dador y aceptor en la que la transferencia de energía es eficaz en un 50 %. También se conocen otros mecanismos de desactivación de fluorescencia, tales como, desactivación por transferencia colisional y de carga.

Normalmente, los procedimientos de detección basados en FRET están diseñados de tal forma que fluoróforo dador y las moléculas aceptoras estén muy próximos de modo que la desactivación de la fluorescencia del dador sea eficaz. Durante el ensayo, las moléculas de dador y aceptor se separan de tal forma que se produce la fluorescencia. Se han desarrollado ensayos de detección basados en FRET en los campos de la hibridación de ácidos nucleicos y enzimología. Varias formas de los ensayos de hibridación de FRET están revisadas (Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, Inc., San Diego 1992, p. 311-352) .

Desde su descubrimiento, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha revolucionado la biología molecular. Esta técnica permite la amplificación de secuencias de ADN específicas, permitiendo así que se ejecuten ensayos de sondas de ADN a partir de una única copia de diana de ADN. Inicialmente no se han usado ensayos diagnósticos basados en PCR de forma rutinaria, en parte debido a problemas con la manipulación de la muestra y la posible contaminación con ADN de otra fuente. Recientemente, se han descrito nuevos ensayos de ADN basados en fluorescencia homogéneos, que pueden detectar el progreso de PCR mientras se produce (detección de PCR "en tiempo real") usando cicladores térmicos espectrofluorimétricos. Dos formatos de ensayo populares usan sondas de ADN que se vuelven fluorescentes mientras se produce la amplificación de ADN (sondas fluorogénicas) .

El primer formato de PCR "en tiempo real" usa sondas de ADN conocidas como "balizas moleculares" (Tyagi et al., Nat. Biotech., 16: 49-53 (1998) ) . Las balizas moleculares tienen una estructura de horquilla en la que el colorante desactivador y el colorante indicador están en contacto íntimo entre sí el extremo de la base de la horquilla. Después de la hibridación con una secuencia complementaria, el bucle de la estructura de horquilla se vuelve bicatenario y fuerza que el colorante desactivador e indicador se aparten, generando así una señal fluorescente. Tyagi et al. informaron del uso de los colorantes desactivadores no fluorescentes incluyendo el resto dabcilo (4-{[4- (dimetilamino) fenil]diazenil}benzoílo, absorbancia máx. = 453 nm) usados en combinación con colorantes indicadores fluorescentes con una longitud de onda de emisión que varía ampliamente (475-615 nm) . En el momento esto era sorprendente, ya que la FRET requiere un solapamiento considerable del espectro de absorción del desactivador y del espectro de emisión del indicador. En el caso de un desactivador que contenga un resto dabcilo (en lo sucesivo, "dabcilo") y algunos colorantes fluorescentes, el solapamiento espectral fue extremadamente bajo, aunque la eficacia de desactivación fue alta. Por lo tanto, se propuso que el mecanismo de desactivación para la forma de horquilla de las balizas no fuera la FRET, sino la desactivación colisional. De hecho, el espectro UV del desactivador cambia en la forma de horquilla de la baliza, proporcionando evidencias del contacto molecular y, por lo tanto, de desactivación colisional. Un procedimiento de detección relacionado usa cebadores de horquilla como sonda fluorogénica (Nazarenko et al., Nucl. Acid Res., 25: 2516-2521 (1997) ) .

El segundo formato para PCR "en tiempo real" usa sondas de ADN que se denominan "sondas de 5'-nucleasa" (Lee et al., Nucl. Acid Res., 21: 3761-3766 (1993) ) . Normalmente, estas sondas fluorogénicas se preparan con el desactivador en el extremo 3' de una cadena de ADN simple y el fluoróforo en el extremo 5'. Durante cada ciclo de PCR, la actividad de 5'-nucleasa de la Taq ADN polimerasa escinde la cadena de ADN, separando de este modo el fluoróforo del desactivador y liberando la señal fluorescente. El ensayo de 5'-nucleasa requiere que la sonda se hibride a la cadena plantilla durante la etapa de extensión del cebador (60-65 ºC) . También dan a conocer la detección "en tiempo real" simultánea de más de una secuencia de polinucleótidos en el mismo ensayo, usando más de un par fluoróforo/desactivador. El ensayo de PCR de 5'-nucleasa se representa en la figura 1.

Inicialmente se pensaba que las sondas de 5'-nucleasa se tenían que preparar con el desactivador (normalmente tetrametilrodamina (TAMRA) ) situado en un nucleótido interno muy próximo al 5'-fluoróforo (normalmente fluoresceína (FAM) o tetraclorofluoresceína (TET) ) para obtener una FRET eficaz. Más tarde se demostró que esto no es necesario, y que el desactivador y el fluoróforo se pueden situar en el extremo 3' y 5' del ODN, respectivamente. Se ha propuesto que las estructuras en espiral aleatorias formadas por estas sondas fluorogénicas en disolución permiten que un colorante 3'-desactivador pase dentro del radio de Forster del 5'-fluoróforo durante el estado excitado de la molécula.

Previamente se han descrito varios pares dador/aceptor; importante para la presente invención es el dabcilo que se usa, por ejemplo, como un desactivador de sulfonamida de dansilo en quimiosensores (Rothman y Still (1999) Med. Chem. Lett. 22, 509 -512) .

Sorprendentemente, no se han publicado informes sobre el uso de dabcilo en sondas de 5'-nucleasa u otras sondas de FRET que usen fluoróforos de longitud de onda larga. Como se menciona anteriormente, se usó dabcilo en las sondas de tipo baliza pero este es un mecanismo de desactivación diferente en el que el dabcilo y el fluoróforo están en contacto íntimo (desactivación colisional) . Se usó dabcilo en péptidos fluorogénicos como desactivador para el fluoróforo EDANS (ácido 5-[ (2-aminoetil) amino]naftaleno-1-sulfónico) que emite a una longitud de onda corta (490 nm, azul) (Matayoshi et al. Science 247: 954-958 (1990) ) . EDANS también tiene un coeficiente de extinción menor que dabcilo por lo que no es sorprendente que la desactivación fluorescente sea eficaz. Se observó por primera vez en la presente invención que se puede usar dabcilo para desactivar la fluoresceína en un mecanismo de... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de oligonucleótido que tiene la fórmula FL-ODN-Q

en la que ODN es un oligonucleótido o ácido nucleico;

FL es un resto fluoróforo unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, y Q es un resto desactivador unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo el resto desactivador la estructura en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y en la que el resto desactivador se une al enlazador a través del enlace de valencia designado a.

2. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R0 es H, R1 es NO2 en la posición 4 del núcleo de benceno, R2 es H o Cl en la posición 2 del núcleo de benceno, y R3 y R4 son hidrógeno y R5 es 15 etilo.

3. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el resto desactivador y el enlazador que lo une al ODN comprende las estructuras seleccionadas de los restos mostrados por las fórmulas Q-1, Q-2 y Q-3

en las que q es de 1 a 20, X es -O-, -OCH2-o CH2-; t y v son independientemente de 1 a 20, r y s son independientemente de 1 a 20, y el resto de desactivador y enlazador conjugados se une al ODN a través de uno de los enlaces de valencia designados a o b.

4. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además un resto de ligando del surco menor unido al conjugado desactivador-enlazador a través de uno de los enlaces de valencia designados a o b.

5. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el resto desactivador y el enlazador que lo une al ODN comprende las estructuras seleccionadas de los restos mostrados por las fórmulas Q-4 y Q-5

en la que R6 es - (CH2) n* en la que n* es de 1 a 20, y q, r, t y v son independientemente de 1 a 20, y en la que el resto desactivador se une al ODN a través del enlace de valencia designado a.

6. Un reactivo de fosforamidita para preparar un conjugado oligonucleótido-fluoróforo-desactivador, incluyendo el reactivo el resto

en el que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y un resto bis (metiletil) amino] (2-cianoetoxi) fosfinooxi unido covalentemente a él.

7. Un reactivo de fosforamidita de acuerdo con la reivindicación 6, que tiene la fórmula seleccionada del grupo que consiste en las fórmulas designadas PA-1, PA-2 y PA-3.

en las que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= - (CH2) n''-CH3 en la que n"= 0 a 5, q es de 1 a 20, X es -O-o -CH2-; t, v, r y s son independientemente de 1 a 20, y X2 es H o dimetoxitritilo, metoxitritilo, tritilo o un grupo de bloqueo lábil en ácido.

8. Un conjugado de oligonucleótido que tiene la fórmula FL-ODN-Q-MGB;

o en la que ODN es un oligonucleótido o ácido nucleico;

FL es un fluoróforo unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, y Q es un resto desactivador unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo el resto desactivador la estructura en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H, - (CH2) n''-CH3 o - (CH2) n'' en las que n"= 0 a 5, y MGB es un resto de enlace del surco menor unido covalentemente al resto de ODN o al resto desactivador a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, y en el que cuando el MGB se une covalentemente 15 al ODN el resto desactivador sólo se une al ODN.

9. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el resto MGB se une al resto desactivador, y el resto MGB-Q unido covalentemente tiene la estructura en la que t y v son independientemente de 1 a 20, y el enlace de valencia designado a une el resto MGB-Q al resto ODN.

10. Un oligonucleótido de conjugado de acuerdo con la reivindicación 9, en el que R0 es H, R1 es NO2 en la posición 4 del núcleo de benceno, R2 es H o Cl en la posición 2 del núcleo de benceno, y R3 y R4 son hidrógeno.

11. Un reactivo desactivador y ligando del surco menor unidos covalentemente para las síntesis de oligonucleótidos, que tienen la fórmula

en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en las que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n' = 0 a 5 o -NC, y t y v son independientemente de 1 a 20;

X2 es H o dimetoxitritilo, metoxitritilo, tritilo o un grupo de bloqueo lábil en ácido, y X3 es pentafluorofeniloxi o NH-ENLAZADOR-CPG o O-ENLAZADOR-CPG en los que CPG es un soporte sólido polimérico y ENLAZADOR es un resto de enlace que tiene una longitud de 0 a 30 átomos uniendo el resto tricíclico al CPG.

12. Un reactivo desactivador y ligando del surco menor unidos covalentemente de acuerdo con la reivindicación 11, en el que R0 es H, R1 es NO2 en la posición 4 del núcleo de benceno, R2 es H o Cl en la posición 2 del núcleo de 10 benceno, R3 y R4 son hidrógeno y v=t=3.

13. Un conjugado de oligonucleótido que tiene la fórmula FL-ODN-Q

en la que ODN es un oligonucleótido o ácido nucleico;

Q es un resto desactivador unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 15 átomos, el resto desactivador comprende la estructura en el que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y FL es un fluoróforo unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo dicho resto fluoróforo la estructura seleccionada del grupo designado FL-1 y FL-2, en las que R8 y R9 son independientemente H, halógeno, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, o -CN; -ORnn, -SRnn, -NHRnn, -N [Rnn]2 en las que Rnn es independientemente H, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

R10 y R11 son independientemente H, -CN, -OR12, N (R12) 2, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, N[ (CH2) nCH3]2 en las que n = 0 a 5, o R12 es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos; y el enlace de valencia designado a simboliza la unión covalente del fluoróforo con el enlazador.

14. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende adicionalmente un resto de ligando del surco menor (MGB) unido al resto desactivador a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, de modo que el conjugado de oligonucleótido tiene la fórmula FL-ODN-Q-MGB.

15. Un conjugado de oligonucleótido de la fórmula en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) n*CH3, - (CH2) n*-CH3 en las que n*= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n' = 0 a 5 o -CN;

FL es un resto fluoróforo con longitudes de onda de emisión en el intervalo de aproximadamente 300 a aproximadamente 800 nm;

K es un enlazador que contiene de 1 a 30 átomos seleccionados del grupo que consiste en C, O, N, S, P y H;

[A-B]n simboliza un ODN, ADN, ARN o APN o cualquier combinación de los mismos, en la que A es el esqueleto azúcar-fosfato en el que el azúcar y el fosfato se pueden modificar independientemente; B es una base heterocíclica, en la que B se selecciona independientemente de las bases purinas, pirimidina, pirazolo[3, 4-d]pirimidina, pirazolo[3, 4-d]pirimidina 7-sustituida, 7-deazapurina, 7-deazapurina 7-sustituida, y purina y pirimidina modificadas, y en la que el ADN, ARN, APN u ODN pueden incluir cualquier combinación de estas bases, y y n es el número de unidades de nucleótidos en dicho ADN, ARN APN u ODN que está entre 2 y 101;

W es N, y m es un número entero que tiene los valores de 1 a 20.

16. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 15, en el que R0 es H, R1 es NO2 en la posición 4 del núcleo de benceno, R2 es H o Cl en la posición 2 del núcleo de benceno, y R3 y R4 son hidrógeno.

17. Un conjugado de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho resto fluoróforo tiene la estructura seleccionada del grupo designado FL-1 y FL-2, en la que R8 es OH u O-alcanoílo, en la que el grupo alcanoílo tiene de 1 a 10 carbonos; R9 es H o alquilo de 1 a 10 carbonos; R10 y R11 son independientemente H, -OR12, -NHR13, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, -N[ (CH2) nCH3]2 o -CN en las que n = 0 a 5; y R12 y R13 son grupos de bloqueo compatibles con la síntesis de ODN; el enlace de valencia designado a simboliza la unión covalente del fluoróforo con el enlazador K.

18. Un reactivo de fosforamidita para preparar un conjugado oligonucleótido-fluoróforo-desactivador, teniendo el reactivo la fórmula en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en las que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y

en la que FL es un fluoróforo unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo dicho resto fluoróforo la estructura seleccionada del grupo designado FL-1 y FL-2

en el que R8 y R9 son independientemente H, halógeno, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, o -CN; -ORnn, -SRnn, -NHRnn, -N[Rnn]2 en los que Rnn es independientemente H, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

R10 y R11 son independientemente H, -CN, -OR12, -N (R12) 2, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, -N[ (CH2) nCH3]2 en las que n = 0 a 5, o R12 es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en las que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y FL es un resto fluoróforo unido covalentemente al ácido nucleico a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo el resto fluoróforo la estructura seleccionada del grupo designado FL-1 y FL-2

o bien un FL-ácido-nucleico-Q-MGB en el que FL es un resto fluoróforo unido covalentemente al ácido nucleico a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, MGB es el resto de ligando del surco menor unido covalentemente al resto ODN o al resto desactivador a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos y Q es un resto desactivador unido covalentemente al ácido nucleico a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo el resto desactivador la estructura en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y en la que el resto desactivador se une al enlazador a través del enlace de valencia designado a.

24. Un procedimiento para hibridar ácidos nucleicos, comprendiendo las etapas de:

(a) proporcionar un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico,

(b) incubar los ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación, e

(c) identificar ácidos nucleicos hibridados;

en el que al menos uno de los ácidos nucleicos comprende o bien un conjugado

o bien FL-ODN-Q-MGB en el que ODN es un ácido nucleico o un ácido nucleico que contiene una o más bases modificadas, MGB es un resto de ligando del surco menor unido covalentemente al resto ODN o al resto desactivador a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, Q es un resto desactivador unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, y FL es un resto fluoróforo unido covalentemente al ácido nucleico a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, y teniendo el resto fluoróforo la estructura seleccionada del grupo designado FL-1 y FL-2,

en las que R8 y R9 son independientemente H, halógeno, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, o -CN; -ORnn, -SRnn, -NHRnn, -N[Rnn]2 en las que Rnn es independientemente H, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

R10 y R11 son independientemente H, -CN, -OR12, N (R12) 2, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, -N[ (CH2) nCH3]2 en las que n = 0 a 5, o R12 es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

el enlace de valencia designado a simboliza la unión covalente del fluoróforo con el enlazador; y Q comprende un resto diazo que tiene la fórmula: longitud de 0 a 30 átomos, Q es un resto desactivador unido covalentemente al ODN a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo el resto desactivador la estructura

en la que R0, R1, R2, R3 y R4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en las que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N[ (CH2) n'CH3]2 en la que n'= 0 a 5 o -CN, y R5= -H o - (CH2) n''CH3 en la que n"= 0 a 5, y FL es un resto fluoróforo unido covalentemente al ácido nucleico a través de un enlazador que tiene la longitud de 0 a 30 átomos, teniendo dicho resto fluoróforo la estructura seleccionada del grupo designado FL-1 y FL-2

en las que R8 y R9 son independientemente H, halógeno, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, o -CN; -ORnn, -SRnn, -NHRnn, -N[Rnn]2 en las que Rnn es independientemente H, un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

R10 y R11 son independientemente H, -CN, -OR12, N (R12) 2, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3, -NO2, -SO3, -C (=O) NH2, -N[ (CH2) nCH3]2 en las que n = 0 a 5, o R12 es un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos o un grupo alcanoílo de 1 a 10 carbonos;

el enlace de valencia designado a simboliza la unión covalente del fluoróforo con el enlazador; y Q comprende un resto diazo que tiene la fórmula:

en la que R0, R1, R2, R3 yR4 son independientemente -H, halógeno, -O (CH2) nCH3, - (CH2) nCH3 en la que n= 0 a 5, -NO2, -SO3, -N