Sondas fluorescentes para la detección de ADN mediante hibridación con una sensibilidad mejorada y baja señal de fondo.

Una sonda de oligonucleótidos que comprende una porción de oligonucleótido que tiene un extremo 3' y un extremo 5',

una unidad estructural de ligador del surco menor anexada a al menos una de dichas unidades de nucleótidos a través de un grupo enlazante el cual liga covalentemente la unidad estructural ligadora del surco menor al oligonucleótido y un fluoróforo y detenedor, teniendo dicha sonda la fórmula;**Fórmula**

en donde MB es un ligador del surco menor; Q es un detenedor; FI es un fluoróforo; [A-B]n representa un oligómero de ácido nucleico que tienen n unidades, en donde n es un entero de 5 a 50; cada A representa independientemente un componente de esqueleto de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de un esqueleto de fosfato de azúcar, un esqueleto modificado de fosfato de azúcar, una cadena principal de ácido nucleico bloqueado, un esqueleto peptídico o una variante del mismo usado en la preparación de ácido nucleico; y cada B representa independientemente una base de ácido nucleico, una base modificada o un análogo de base; K es un enlace o un grupo enlazante; y W es un grupo enlazante trivalente que provee suficiente espacio entre MB, FI y [A-B]n de tal forma que (i) MB se une a un surco menor dúplex formado cuando dicha sonda de oligonucleótidos se hibrida a su secuencia complementaria; (ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de FI en dicha sonda de oligonucleótidos es menos de 10% de la fluorescencia no detenida; y (iii) cuando dicha sonda de oligonucleótidos se hibrida a dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de FI es al menos 50% de su fluorescencia no detenida.

Sondas fluorescentes para la detección de ADN mediante hibridación con una sensibilidad mejorada y baja señal de fondo.

Antecedentes de la invención

Las sondas de ADN son herramientas establecidas para la detección y cuantificación de secuencia. La eficiencia y la precisión de la detección de secuencias dependen tanto de la especificidad de hibridación de la sonda como de su sensibilidad. La fluorescencia es una de las formas más comunes para detectar el evento de hibridación. Los métodos que utilizan sondas fluorescentes para la detección de ácidos nucleicos se basan bien sea en una fluorescencia disparada por la hibridación de sondas intactas (por ejemplo, las balizas moleculares y sondas 1 lineales, véase la Patente de los Estados Unidos No. 6,3,787, la Patente de los Estados Unidos No. 6,214,979, la Patente de los Estados Unidos No. 5,925,517, la Patente de los Estados Unidos No.5,723,591 y la solicitud de los Estados Unidos Serie No. 1/165,41) o en una liberación de fluorescencia detenida de una sonda digerida por ADN polimerasa (por ejemplo, los métodos que utilizan TaqMan, MGB-TaqManMGB es una marca comercial de Epoch Biosciences). Para aquellos métodos que utilizan TaqMan y MGB-TaqMan, la actividad de 5-exonucleasa de la ADN 15 Polimerasa que se aproxima escinde una sonda entre fluoróforo y detenedor liberando así la fluorescencia. Estos tipos de sondas son adecuados para la detección de la amplificación de ADN en tiempo real. El primer tipo de sondas, sin embargo, también puede ser aplicado para la detección de secuencia post-amplificación (análisis gráfico de dispersión o de fusión térmica) o en un formato en fase sólida. Sondas fluorescentes detenidas en fase sólida se han divulgado en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,876,93 y 6,596,49, y se han utilizado 2 para detectar ácidos nucleicos objetivo. Las sondas de hibridación divulgadas tienen bien sea bajas relaciones de señal a fondo o ratas de hibridación lentas (Xiaohong Fang et al. J.Am.Chem.Soc. 1999, 121: 2921-2922) y, fluorescencia de fondo inestable dependiente de la temperatura (fluorescencia en estado no hibridado), lo que las hace inadecuadas para las aplicaciones de amplificación en tiempo real.

Lo que se necesita en la técnica son nuevas sondas de oligonucleótidos con alta especificidad de secuencia, 25 sensibilidad mejorada (relación de señal a fondo), señal de fondo estables (independientes de la temperatura) y rápidas ratas de hibridación. También es necesario que las sondas se puedan preparar fácilmente con una variedad de nucleótidos naturales y no naturales, marcadores fluorescentes y en diversas longitudes. La presente invención provee dichas sondas, así como los métodos para su preparación y uso.

La WO 3/62445A2 divulga sondas de oligonucleótidos/conjugados junto con su uso en ensayos para monitorizar 3 la amplificación en donde la señal producida no se basa en la digestión de 5nucleasa

Breve resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención provee sondas de oligonucleótidos que comprenden una porción de oligonucleótido que tiene un extremo 3' y un extremo 5', una unidad estructural ligadora de surco menor unida a al menos una de dichas unidades de nucleótidos a través de un grupo enlazante el cual liga covalentemente la unidad 35 estructural ligadora de surco menor al oligonucleótido, y un fluoróforo y detenedor, teniendo dicha sonda la fórmula;

MB

Fl

]

-W-

B

K

Q

en donde MB es un ligador del surco menor; Q es un detenedor; F1 es un fluoróforo; [A-B]n representa un oligómero de ácido nucleico que tienen unidades n, en donde n es un entero de 5 a 5; cada A representa independientemente un componente de de esqueleto de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de un esqueleto de fosfato 4 de azúcar, un esqueleto modificado de fosfato de azúcar, una cadena principal de ácido nucleico bloqueado, un esqueleto peptídico o una variante del mismo usado en la preparación de ácido nucleico; y cada B representa independientemente una base de ácido nucleico, una base modificada o un análogo de base; K es un enlace o un grupo enlazante; y W es un grupo enlazante trivalente que provee suficiente espacio entre MB, F1 y [A-B]n de tal forma que (i) MB se une a un surco menor dúplex formado cuando dicha sonda de oligonucleótidos se híbrida con su 45 secuencia complementaria; (ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de F1 en dicha sonda de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y (iii) cuando dicha sonda de oligonucleótidos se híbrida con dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de F1 es al menos 5% de su fluorescencia no detenida.

En algunas realizaciones, W provee espaciamiento entre MB, Fl y [A-B]n de tal forma que en una forma no hibridada, la fluorescencia de F1 en dicha sonda de oligonucleótidos es menor de aproximadamente 1% de la fluorescencia 5 no detenida. En otras realizaciones, W es un miembro seleccionado del grupo que consiste de:

en donde el subíndice q es un entero de a 8; y A°, A1 y A2 son cada uno grupos enlazantes (por ejemplo, arilo, alqulleno, alqulleno sustituido, heteroalqulleno, heteroalquileno sustituido y combinaciones de los mismos) que tienen de 1 a 5 átomos de la cadena principal, y las líneas onduladas indican el punto de unión a MB, Fl y la 5 porción de [A-B]n.

En todavía otras realizaciones, n es un entero de 6 a 18, y dicha porción de [A-B]n comprende al menos tres nucleótidos de guanina consecutivos en donde al menos una de las bases de nucleótidos de guanina es sustituida por PPG. Preferiblemente, la porción [A-B]n es un ADN, ARN, quimera, un PNA o un ácido nucleico bloqueado. En aún otras realizaciones, n es un entero de 6 a 18, siendo dicha sonda complementaria a una secuencia objetivo que 1 tiene al menos 3% de adenina y bases de timina, en donde dicha sonda contiene al menos una base modificada suficiente para proveer un incremento de la estabilidad de la formación dúplex de al menos 3 °C, con respecto a una sonda sin dicha al menos una base modificada. En ciertas realizaciones, la sonda es complementaria a una secuencia objetivo que tiene al menos 5% de adenina y bases de timina, en donde dicha sonda contiene suficientes bases modificadas para proveer un incremento de la estabilidad de la formación dúplex de al menos 5 °C, 15 con respecto a una sonda sin dichas bases modificadas.

En aspectos relacionados, la presente invención provee métodos y disposiciones para la utilización de las sondas descritas aquí.

En un aspecto relacionado, la presente invención provee métodos para la monitorización continua de amplificación de polinucleótidos, que comprende:

(a) combinar una muestra que contiene una secuencia objetivo, con uno o más cebadores de oligonucleótidos

complementarios a las regiones de la secuencia objetivo, una enzima de polimerización, sustratos de nucleótidos y un conjugado de oligonucleótidos que tiene una fórmula:

Fl

MB-WODN K-Q

en donde MB es un ligador del surco menor, Q es un detenedor, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido 25 modificado que tiene una secuencia que es complementaria a una porción de dicha secuencia objetivo que es amplificada, K es un enlace o un grupo enlazante, Fl es un fluoróforo, W es un grupo enlazante trivalente que provee suficiente espacio entre los componentes MB, F y ODN de tal forma que: i) MB se une en el surco menor cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida con dicha secuencia objetivo; ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de F1 en dicho conjugado de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y iii) 3 cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de F1 es al menos 5% de su fluorescencia no detenida; provee una mezcla;

(b) incubar dicha mezcla bajo condiciones favorables para la amplificación de dicho polinucleótido; y

(c) monitorizar continuamente dicha amplificación mediante la monitorización de la fluorescencia producida tras la hibridación conjugada al objetivo amplificado. En algunas realizaciones preferidas, la porción de MB se selecciona

del grupo que consiste de análogos de CC165, lexitropsinas, distamicina, netropsina, berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2-fenilindol y análogos de pirrolo[2,1-c] [1,4]benzodiazepina. En otras realizaciones preferidas, la porción Fl es un fluoróforo que tiene una longitud de onda de emisión de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 8 nm, siendo seleccionado dicho fluoróforo del grupo que consiste de cumarinas, resorufinas, xantenos, benzoxantenos, cianinas, y análogos de BODIPY. En todavía otras realizaciones... [Seguir leyendo]

1. Una sonda de oligonucleótidos que comprende una porción de oligonucleótido que tiene un extremo 3' y un extremo 5', una unidad estructural de ligador del surco menor anexada a al menos una de dichas unidades de nucleótidos a través de un grupo enlazante el cual liga covalentemente la unidad estructural ligadora del surco menor al oligonucleótido y un fluoróforo y detenedor, teniendo dicha sonda la fórmula;

B

I

A------Kv

Jn G

en donde MB es un ligador del surco menor; Q es un detenedor; Fl es un fluoróforo; [A-B]n representa un oligómero de ácido nucleico que tienen n unidades, en donde n es un entero de 5 a 5; cada A representa independientemente un componente de esqueleto de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de un esqueleto de fosfato de azúcar, un esqueleto modificado de fosfato de azúcar, una cadena principal de ácido nucleico bloqueado, un esqueleto peptídico o una variante del mismo usado en la preparación de ácido nucleico; y cada B representa independientemente una base de ácido nucleico, una base modificada o un análogo de base; K es un enlace o un grupo enlazante; y W es un grupo enlazante trivalente que provee suficiente espacio entre MB, Fl y [A-B]n de tal forma que (i) MB se une a un surco menor dúplex formado cuando dicha sonda de oligonucleótidos se híbrida a su secuencia complementaria; (¡i) en una forma no hibridada, la fluorescencia de Fl en dicha sonda de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y (iii) cuando dicha sonda de oligonucleótidos se hibrida a dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de Fl es al menos 5% de su fluorescencia no detenida.

2. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde W provee separación entre MB, Fl y [A-B]n de tal manera que en una forma no hibridada, la fluorescencia de Fl en dicha sonda de oligonucleótidos es menos de 3% de la fluorescencia no detenida.

3. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde W es un miembro seleccionado del grupo que consiste de:

en donde q es un entero de a 8; y A°, A1 y A2 son cada uno grupos enlazantes que tiene de 1 a 5 átomos de la cadena principal con porciones seleccionadas del grupo que consiste de arllo, alqulleno, alquileno sustituido, heteroalqulleno, heteroalquileno sustituido y combinaciones de los mismos; y en donde las líneas onduladas indican los puntos de unión a MB, Q y [A-B]n.

4. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde n es un entero de 6 a 18, y dicha porción de [A-B]n comprende al menos tres nucleótidos de guanina consecutivos en donde al menos una de las bases de nucleótidos de guanina es reemplazada por PPG.

5. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 4, en donde dicha porción de [A-B]n es un ADN, un ARN, quimera, un ANP o un ácido nucleico bloqueado.

6. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde n es un entero de 6 a 18, siendo dicha sonda complementaria a una secuencia objetivo que tiene al menos 3% de bases de adenina y timina, en donde dicha sonda contiene al menos una base modificada suficiente para proveer un incremento de la estabilidad de la formación de dúplex de al menos 3°C, con relación a una sonda sin dicha al menos una base modificada.

7. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 6, en donde dicha porción [A-B]n es un ADN, un ARN, quimera, un ANP o un ácido nucleico bloqueado.

8. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 6, en donde dicha sonda es complementaria a una secuencia objetivo que tiene al menos 5% bases de adenina y timina, en donde dicha sonda contiene bases modificadas suficientes para proveer un incremento de la estabilidad de la formación de dúplex de al menos 5°C, con respecto a una sonda sin dichas bases modificadas.

9. Una sonda de oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde

ivb rvc

1. Un método para la monitorización continua de amplificación de polinucleótidos, que comprende:

(a) combinar una muestra que contiene una secuencia objetivo, con uno o más cebadores de oligonucleótidos complementarios a las regiones de la secuencia objetivo, una enzima de polimerización, los sustratos de nucleótidos, y un conjugado de oligonucleótidos que tiene una fórmula:

Fl

MB-WODN K-Q

en donde MB es un ligador del surco menor, Q es un detenedor, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia que es complementaria a una porción de dicha secuencia objetivo que es amplificada, K es un enlace o un grupo enlazante, Fl es un fluoróforo, W es un grupo enlazante trivalente que provee espacio suficiente entre los componentes MB, F y ODN de tal forma que: i) MB se liga en el surco menor cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo; ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de Fl en dicho conjugado de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y iii) cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida con dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de Fl es al menos 5% de su fluorescencia no detenida; provee una mezcla;

(b) incubar dicha mezcla bajo condiciones favorables para la amplificación de dicho polinucleótido; y

(c) monitorizar continuamente dicha amplificación monitorizando la fluorescencia producida tras la hibridación del conjugado al objetivo amplificado

11. Un método de la reivindicación 1, en donde dicha porción de MB es seleccionada del grupo que consiste de análogos de CC165, lexitropsinas, distamicina, netropsina, berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2- fenilindol y análogos de pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepina.

12. Un método de la reivindicación 1, en donde dicha porción Fl es un fluoróforo que tiene una longitud de onda de emisión de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 8 nm, siendo dicho fluoróforo seleccionado del grupo que consiste de cumarinas, resorufinas, xantenos, cianinas benzoxantenos, y análogos BODIPY.

13. Un método de la reivindicación 1, en donde dicha porción de Q es un miembro seleccionado del grupo que 5 consiste de colorantes mono azo y bis azo.

14. Un método de la reivindicación 1, en donde dicha porción de ODN de dicho conjugado es de 8-25 nucleótidos de longitud.

15. Un método de la reivindicación 1, en donde dicha porción de ODN de dicho conjugado es de 8-15 nucleótidos de longitud y K es un enlazador que tiene una longitud de 1-5 átomos de la cadena principal seleccionado del

grupo que consiste de C, O, N, S , P y Si.

16. Un método de la reivindicación 1, en donde W y Ktienen fórmulas IVby IVc, respectivamente.

17. Un método para monitorizar la expresión génica que comprende:

(a) proveer una disposición de sondas de oligonucleótidos de secuencias diferentes,

(b) incubar una población de polinucleótidos con disposición bajo condiciones de hibridación, y

(c) determinar a cuál de las sondas de oligonucleótidos en la disposición híbrida la población;

en donde una o más de las sondas de oligonucleótidos es un conjugado de oligonucleótidos que tiene la fórmula:

Fl

MB-WODN-----K-Q

en donde MB es un ligador del surco menor, Q es un detenedor, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia que es complementaria a una porción de dicha secuencia objetivo que es 2 amplificada, K es un enlace o un grupo enlazante, Fl es un fluoróforo, W es un grupo enlazante trivalente que provee espacio suficiente entre los componentes MB, F y ODN de tal forma que: i) MB se liga en el surco menor cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo; ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de Fl en dicho conjugado de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y iii) cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de Fl es al 25 menos 5% de su fluorescencia no detenida.

18. Un método de la reivindicación 17, en donde dicha porción de MB es seleccionada del grupo que consiste de análogos de CC165, lexitropsinas, distamicina, netropsina, berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2- fenilindol y análogos de pirrolo[2,1 -c][1,4]benzodiazepina, dicha porción Fl es un fluoróforo que tiene una longitud de onda de emisión de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 8 nm, siendo dicho fluoróforo seleccionado del

grupo que consiste de cumarinas, resorufinas, xantenos, cianinas benzoxantenos, y análogos BODIPY, y dicha porción Q es un miembro seleccionado del grupo que consiste de colorantes mono azo y bis azo.

19. Un método de la reivindicación 18, en donde dichos conjugados se unen a un soporte sólido.

2. Un método de la reivindicación 17, en donde W y Ktienen las fórmulas IVb y IVc, respectivamente.

21. Un método para discriminar entre polinucleótidos los cuales difieren por un nucleótido sencillo, comprendiendo el

método:

(a) incubar por separado cada uno de al menos dos polinucleótidos con un conjugado de oligonucleótidos que tiene la fórmula:

Fl

MB-WODN K-Q

en donde MB es un ligador del surco menor, Q es un detenedor, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido 4 modificado que tiene una secuencia que es complementaria a una porción de dicha secuencia objetivo que es amplificada, K es un enlace o un grupo enlazante, Fl es un fluoróforo, W es un grupo enlazante trivalente que provee espacio suficiente entre los componentes MB, F y ODN de tal forma que: i) MB se liga en el surco menor cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo; ii) en una forma no hibridada, la

fluorescencia de Fl en dicho conjugado de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y iii) cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida con dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de Fl es al menos 5% de su fluorescencia no detenida, teniendo dicho conjugado una secuencia definida bajo condiciones de hibridación, en donde uno de los polinucleótidos tiene una secuencia objetivo que es perfectamente complementaria a dicho conjugado de oligonucleótidos y al menos otro de los polinucleótidos tiene una secuencia objetivo que tiene una no coincidencia de un nucleótido individual con el conjugado de oligonucleótidos; y (b) determinar la fuerza de hibridación entre cada uno de los polinucleótidos y el conjugado de oligonucleótidos.

22. Un método de la reivindicación 21, en donde dicha porción de MB es seleccionada del grupo que consiste de análogos de CC165, lexitropsinas, distamicina, netropsina, berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2- fenilindol y análogos de pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepina, dicha porción Fl es un fluoróforo que tiene una longitud de onda de emisión de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 8 nm, siendo dicho fluoróforo seleccionado del grupo que consiste de cumarinas, resorufinas, xantenos, cianinas benzoxantenos, y análogos BODIPY, y dicha porción de Q es un miembro seleccionado del grupo que consiste de colorantes mono azo y bis azo.

23. Un método para la reivindicación 21, en donde

O

rvb

IVc

24. Un método para detectar una secuencia objetivo en un polinucleótido, en donde el polinucleótido está presente en una mezcla de otros polinucleótidos, y en donde uno o más de los otros polinucleótidos en la mezcla comprenden secuencias que están relacionadas pero no son idénticas a la secuencia objetivo, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la mezcla de polinucleótidos con un conjugado de oligonucleótidos que tiene la fórmula:

Fl

MB-W ODN----K-Q

en donde MB es un ligador del surco menor, Q es un detenedor, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, K es un enlace o un grupo enlazante, Fl es un fluoróforo y W es un grupo enlazante trivalente que provee suficiente espacio entre los componentes MB, F y ODN de tal forma que: i) MB se liga en el surco menor cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo; ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de Fl en dicho conjugado de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y iii) cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida con dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de Fl es al menos 5% de su fluorescencia no detenida; y en donde el conjugado forma un híbrido estable solamente con dicha secuencia objetivo que es perfectamente complementaria a la porción de ODN de dicho conjugado, y el conjugado no forma un híbrido estable con cualquiera de los otros polinucleótidos; y

(b) medir la fluorescencia producida en la formación de híbridos, con lo cual la formación de híbridos indica la presencia de dicha secuencia objetivo.

25. Un método de la reivindicación 24, en donde dicha porción de MB es seleccionada del grupo que consiste de análogos de CC165, lexitropsinas, distamicina, netropsina, berenil, duocarmicina, pentamidina, 4,6-diamino-2- fenilindol y análogos de pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepina, dicha porción Fl es un fluoróforo que tiene una longitud de onda de emisión de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 8 nm, siendo dicho fluoróforo seleccionado del

grupo que consiste de cumarinas, resorufinas, xantenos, cianinas benzoxantenos, y análogos BODIPY, y dicha porción de Q es un miembro seleccionado del grupo que consiste de colorantes mono azo y bis azo.

26. Un método de la reivindicación 24, en donde W y K tienen las fórmulas IVb y IVc, respectivamente.

27. Un método para distinguir entre los polinucleótidos objetivo de tipo silvestre, mutante y heterocigotos, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto una muestra que contiene un polinucleótido objetivo con dos sondas en donde una primera

sonda es específica para dicho polinucleótido objetivo de tipo silvestre y una segunda sonda es específica para dicho polinucleótido objetivo mutante, teniendo cada una de dichas sondas una fórmula:

Fl

MB-WODN K-Q

en donde MB es un ligador del surco menor, Q es un detenedor, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido 15 modificado, K es un enlace o un grupo enlazante, Fl es un fluoróforo y W es un grupo enlazante trivalente que provee suficiente espacio entre los componentes MB, F y ODN de tal forma que: i) MB se liga en el surco menor cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida a dicha secuencia objetivo; ii) en una forma no hibridada, la fluorescencia de Fl en dicho conjugado de oligonucleótidos es menos de 1% de la fluorescencia no detenida; y iii) cuando dicho conjugado de oligonucleótidos se híbrida con dicha secuencia objetivo, la fluorescencia de Fl es al 2 menos 5% de su fluorescencia no detenida; y en donde el conjugado forma un híbrido estable solamente con dicha secuencia objetivo que es perfectamente complementaria a la porción de ODN de dicho conjugado, y el conjugado no forma un híbrido estable con cualquiera de los otros polinucleótidos; y

(b) medir la fluorescencia producida en la formación de híbridos, con lo cual la formación de híbridos indica la presencia o ausencia de cada uno de los polinucleótidos objetivo tipo silvestre, mutantes y heterocigotos.

28. Un método de la reivindicación 27, en donde las temperaturas de fusión (Tm) para cada híbrido producido entre

dichas primera y segunda sondas y sus respectivos objetivos están dentro de aproximadamente 5°C una de la otra.

29. Un método de la reivindicación 27, en donde la porción de ODN de cada una de dichas sondas es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado que tiene de 8 a 18 bases o bases modificadas.

3. Un método de la reivindicación 27, en donde la porción de ODN de cada una de dichas sondas es un

oligonucleótido o un oligonucleótido modificado que tiene de 1 a 15 bases o bases modificadas.

31. Un método de la reivindicación 27, en donde las porciones de fluoróforo de cada una de dichas sondas es seleccionada del grupo que consiste de 5-FAM, 6-FAM, TET, JOE, HEX, VIC, NED, TAMRA, ROX y YY.

32. Un método de la reivindicación 27, en donde la porción de ODN de cada una de dichas sondas contiene al

menos una base modificada.

33. Un método de la reivindicación 32, en donde cada base modificada es seleccionada independientemente del

grupo que consiste de 6-amino- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-ona, 4-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina, 1H- pirazolo[5,4-d]pirimidin-4(5H- 6(7H)-diona, 6-amino-3-prop-1-inil-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, 6-amino-3-(3- hidroxiprop-1-inil)1-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, 6-amino-3-(3-aminoprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-

d]pirimidin-4-ona, 4-amino-3-(prop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, 4-amino-3-(3-hidroxiprop-1-inil)pirazolo[3,4- djpirimidina, 4-amino-3-(3-aminoprop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, 3-prop-1-inil-4,6-diaminopirazolo[3,4- djpirimidina, 2-(4,6-diaminopirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)etin-1-ol, 3-(2-aminoetinil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina,

5- prop-1-inil-1,3-dihidropirimidin-2,4-diona, 5-(3-hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2,4-diona, 6-amino-5-prop-1- ¡nil-3-dihidropirimidin-2-ona, 6-amino-5-(3-hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2-ona, 6-amino-5-(3-aminoprop-1-

¡nil)-1,3-dihidropirimidin-2-ona, 5-[4-amino-3-(3-metoxiprop-1-inil)pirazol[3,4- d]pirimidinil]-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol,

6- amino-1-[4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-3-(3-metoxiprop- 1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, 4-(4,6-

Diamino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-but-3-in-1-ol, 6-Amino-3-(4-hidroxi-but-1-inil)-1,5-dihidro-pirazolo[3,4-

d]pirimidin-4-ona, 5-(4-hidroxi-but-1 -inil)-1 H-pirimidin- 2,4-diona, 3-yodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina, 3- bromo-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diainine, 3-cloro-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina, 3-Yodo-1 H-

pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina, 3-Bromo- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina y 3-cloro-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-

4-ilamina.

34. Un método de la reivindicación 27, en donde dicha muestra se pone en contacto adicionalmente con un conjunto de cebadores bajo condiciones de amplificación y cada uno de dichos cebadores contiene de una a diez bases modificadas seleccionadas del grupo que consiste de 6-amino- 1W-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-ona, 4-amino-1/-/- pirazolo[3,4-d]pirimidina, 1H-pirazolo[5,4-d]pirimidin-4(5H)- 6(7H)-diona, 6-amino-3-prop-1-inil-5-hidropirazolo[3,4- 5 d]pirimidin-4-ona, 6-amino-3-(3-hidroxiprop-1-inil)1-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, 6-amino-3-(3-aminoprop-1-

inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin- 4-ona, 4-amino-3-(prop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, 4-amino-3-(3-hidroxiprop- 1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, 4-amino-3-(3-aminoprop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina, 3-prop-1 -inil-4,6-

diaminopirazolo[3,4-d]pirimidina, 2-(4,6-diaminopirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)etin-1-ol, 3-(2-aminoetinil)p¡razolo[3,4- d]pirimidin-4,6-diamina, 5-prop-1 -inil-1,3-dihidropirimidin-2,4-diona, 5-(3-hi droxí prop-1 -inil )-1,3-di hidropi ri midi n-2,4- 1 diona, 6-amino-5-prop-1-inil-3-dihidropirimidin-2-ona, 6-amino-5-(3-hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimid¡n-2-ona, 6-

amino-5-(3-aminoprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidin-2-ona, 5-[4-amino-3-(3-metoxiprop-1-inil)pirazol[3,4- d]pir¡m¡dinil]-2- (hidroximetil)oxolan-3-ol, 6-amino-1-[4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-3-(3-metoxiprop- 1-inil)-5-hidropirazolo[3,4- d]pirim¡din-4-ona, 4-(4,6-Diamino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-but-3-in-1-ol, 6-Amino-3-(4-hidroxi-but-1-inil)-1,5- dihidro-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona, 5-(4-hidroxi-but-1-inil)-1H-pirimidin-2,4-diona, 3-yodo-1H-pirazolo[3,4- 15 d]pirimidin-4,6-diamina, 3-bromo-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamina, 3-cloro-1 H-pirazolo[3,4-d]pir¡m¡d¡n-4,6-

diamina, 3-Yodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina, 3-Bromo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina y 3-cloro-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina.