MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN.

La eficiente amplificación (multiplicación) mediante PCR se requiere de un modo particular en aplicaciones biológicas en las que se precisa una detección altamente sensible y precisa. En la mayor parte de los programas de diseño de cebadores y sondas se recomienda diseñar primero las sondas y después se diseñan los cebadores próximos a las sondas sin secuencias solapantes (superpuestas) (p. ej. Primer Express Software Version 2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA). Los métodos de amplificación mediante PCR se emplean con profusión en la industria del diagnóstico. De una forma inesperada, los autores de la presente invención han descubierto que el cebador solapante (superpuesto) y la sonda dan aún una eficaz PCR, expandiendo las oportunidades de diseño de sonda y cebador particularmente en entornos de secuencia challenging. El método de PCR y sus aplicaciones clínicas han sido ya descritos (patente de EE.UU. nº 4.683.202; Lynch J R, Brown J M. J Med. Genet., 27: 2 - 7 (1990); Yang S, Rothman R E. Lancet Infect Dis., 4: 337 - 48 (2004)). La representación esquemática de la sonda superpuesta y el cebador en un nuevo método de amplificación de la invención se muestra en la Figura 1. Las sondas 5-minor groove binder (MB) (ligando del surco menor)Quencher (apagador) (Q)oligonucleótido Fluoróforo (Fl)-3 o 5-MBFl oligonucleótido-Q-3 o 5Fl oligonucleótidoQMB3 no han sido solapadas o superpuestas con cebadores. Se sugiere en la bibliografía sobre amplificación mediante PCR que se ha de evitar la complementariedad en los extremos 3 de pares de cebadores ya que ésta promueve la formación de artefactos cebador-dímero y reduce el rendimiento en los productos deseados (Innis, M. y Gelfand, D. Optimization of PCR en Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J. y White, T., Editores. PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLI­ CATIONS . Academic Press, San Diego, CA, páginas 3 - 12, 1989.). Como la sonda y el cebador tienen secuencias complementarias superpuestas y secuencias 3 disponibles, era de esperar que las sondas 5-MBQ-oligonucleótido­ FI-3 o 5MB-FloligonucleótidoQ3 o 5-FI-oligonucleótido-Q-MB-3 que se solapan con un cebador darían una escasa amplificación. Sin embargo se observó de una forma inesperada que tiene lugar una eficiente amplificación en el caso de la Figura 1b. Sin vincularse a ninguna teoría, los autores de la presente invención sospechan que la sonda que contiene un ligando MB, Q y un Fl tiene una conformación apretada en una solución en la que estos componentes están en estrecha proximidad. Los autores de la presente invención han demostrado que tal sonda en solución es apagada a partir de temperaturas que están en el intervalo de 25°C a 95°C, lo que sugiere que solapamientos o superposiciones de 1 a aproximadamente 7 bases no bastan para superar la conformación de la sonda estable en solución para permitir la formación de enlaces de hidrógeno. En la Figura 1a, el dímero Cebador-Sonda no debe dar lugar a ningún artefacto. El extremo 3 no está disponible para el cebado. Sorprendentemente, este tipo de diseño puede proporcionar una buena amplificación. Los documentos WO 03/062445 y US 2003/0175728 A1 están relacionados con sondas de detección lineal en tiempo real: sondas que contienen 5 minor groove binder (ligando del surco menor) para análisis por PCR. El documento de Afonina et al. (2002) Proceedings of SPIE, 4626: 322 a 330 está relacionado con la detección de DNA por fluorescencia desencadenada por hibridación con sondas de ligando del surco menor. El documento de Afonina et al. (2002) PharmaGenomics, enero/febrero 48-54 está relacionado con el tipaje preciso por PCR en tiempo real. El documento de Afonina et al. (2002) Biotechniques 32 (4): 940 - 944 está relacionado con sondas de DNA conjugado con ligando del surco menor para la detección cuantitativa de DNA por fluorescencia desencadenada por hibridación. El documento de Afonina et al. (2002) 25: 268 - 274 está relacionado con la detección de polimorfismo de nucleótido simple con ensayos MGB Eclipse. BREVE SUMARIO DE LA INVENCION. ES 2 365 737 T3 La presente invención describe el método en el que las secuencias de la sonda de oligonucleótido y un cebador de oligonucleótido son superpuestas con aproximadamente una a aproximadamente 7 bases en una amplificación basada en polimerasa. Las sondas y cebadores de la invención son opcionalmente oligonucleótidos modificados. En un grupo de realizaciones, las secuencias del cebador son superpuestas y la diana amplificada se detecta, bien sea indirectamente o con un agente de unión de DNA. Los cebadores y sondas de la invención son oligonucleótidos de aproximadamente 5 a 40 bases, más preferentemente de 5 a 30 bases, con la condición de que sean compatibles con la amplificación por polimerasa. En una realización de la invención, los cebadores y sondas de oligonucleótido contienen las bases naturales, es decir guanina, citosina, adenina, timina o uracilo. En otra realización, las sondas y cebadores de la invención contienen una o más bases no naturales, promiscuas o universales. En otra realización la sonda es una sonda de transferencia de resonancia fluorescente (FRET: fluorescence resonance transfer probe) que contiene un fluoróforo con longitudes de onda de emisión de aproximadamente 400 nm a 2 aproximadamente 900 nm, y un quencher (apagador) con longitudes de onda de absorbancia de aproximadamente 400 nm a aproximadamente 900 nm. Los fluoróforos y los apagadores son disponibles a partir de fuentes comerciales (p. ej. Molecular Probes, Eugene, OR; Epoch Bioscience, Bothell, WA). Típicamente las sondas tienen una longitud de aproximadamente 8 a 30 bases. En otra realización más, la diferencia en las propiedades termodinámicas (G) es suficientemente grande para permitir la superposición o solapamiento sustancial de las secuencias de la sonda y el cebador en la amplificación por PCR. La sonda FRET de detección contiene un ligando del surco menor, un fluoróforo y un apagador. Los conjugados de sonda preferidos tienen la fórmula que se indica en la Fórmula I, en la que Fl A y Fl B pueden ser un fluoróforo o bien un apagador, con la condición de que el conjugado contenga al menos un apagador y al menos un fluoróforo, y n sea 0 o 1. Fórmula I Los dos cebadores solapan de 1 a 7 bases. La diana amplificada se detecta por medio de un reactivo de unión de ácido nucleico. Alternativamente, el material amplificado puede ser detectado indirectamente utilizando un cebador biotinilado y la detección enzimática conocida en la técnica. En otra realización más, el cebador y la sonda superpuestos se usan en la amplificación de dianas con control continuado de la sonda. En otra realización más, el cebador y la sonda superpuestos se usan para amplificar dianas estrechamente relacionadas para la discriminación de disparidades usando al menos una sonda. Las dianas relacionadas son aquellas en las que las secuencias diana difieren en una a tres disparidades, preferentemente en una o dos disparidades. En algunas realizaciones los polimorfismos de nucleótidos simples se determinan por análisis de la curva de fusión post amplificación midiendo la dependencia de la emisión de fluorescencia de cada sonda con la temperatura. En una realización relacionada, el cebador y la sonda superpuestos se usan para amplificar dianas de ácidos nucleicos para la detección del punto final de la sonda fluorescente. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS. La Figura 1 proporciona una representación esquemática de la situación de cebador y sonda en una diana, con una secuencia de cebador solapada con una secuencia de sonda (Figuras 1a y 1b), superposición de cebador-cebador (Figura 1c) y solapamiento de sonda con dos secuencias de cebador (Figura 1d). La Figura 2 proporciona los resultados de un ensayo MGB-Eclipse usando los cebadores y las sondas que se proporcionan en la Tabla 2. La Figura 3 proporciona los resultados de una amplificación por PCR del virus BK. La Figura 4 proporciona un tipaje de polimorfismo de curva de fusión post amplificación por PCR del polimorfismo de MMP-3 en 102 muestras de DNA. La Figura 5 proporciona la relación de señal fluorescente/ruido de una placa post PCR, leída a 25°C en un aparato ABI 7900 para diferentes concentraciones de RNA de Influenza A. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION. ES 2 365 737 T3 Como se señaló antes, la presente invención proporciona métodos de amplificación y métodos de hibridación en los que una sonda de oligonucleótido y un cebador de oligonucleótido tienen secuencias que son solapadas con aproximadamente una a aproximadamente 7 bases en una amplificación basada en polimerasa. Las sondas y cebadores de la invención son opcionalmente oligonucleótidos modificados. Generalmente, los cebadores y sondas de la invención son oligonucleótidos de aproximadamente 5 a 40 bases, más... [Seguir leyendo]

1. Un método para el control continuo de la amplificación de polinucleótidos, que comprende: (a) combinar una muestra que contiene una secuencia diana, con uno o más cebadores de oligonucleótido complementarios a regiones de la secuencia diana, una enzima de polimerización, sustratos de nucleótido, y un conjugado de oligonucleótido que tiene la formula: en la que MB es un ligando del surco menor, n es 0 o 1, uno de los grupos Fl A y Fl B es un fluoróforo y el otro de los grupos Fl A y Fl B es un apagador, W es un grupo de enlace trivalente, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, K es una unión o un grupo de enlace, en donde la secuencia de ODN solapa de 1 a 7 bases con una secuencia de cebador de al menos uno de dichos cebadores y la porción de ODN tiene una secuencia complementaria con una porción de la secuencia diana que se está amplificando, para proporcionar una mezcla; (b) incubar la mezcla bajo condiciones favorables para la polimerización; y (c) controlar en continuo la amplificación controlando la fluorescencia producida al tener lugar la hibridación del conjugado con la diana amplificada. 2. Un método para controlar en continuo la amplificación de polinucleótidos, que comprende: (a) combinar una muestra que contiene una secuencia diana con uno o más cebadores de oligonucleótido complementarios a regiones de la secuencia diana, una enzima de polimerización, sustratos de nucleótido, y un conjugado de oligonucleótido que tiene la formula: en la que MB es un ligando del surco menor, n es 0 o 1, uno de los grupos Fl A y Fl B es un fluoróforo y el otro de los grupos Fl A y Fl B es un apagador, W es un grupo de enlace trivalente, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, K es una unión o un grupo de enlace, la secuencia de ODN que tiene un solapamiento de 1 a 7 bases con una secuencia de cebador de al menos uno de dichos cebadores y la porción de ODN tiene una secuencia complementaria a una porción de la secuencia diana que se está amplificando, para proporcionar una mezcla; (b) incubar la mezcla bajo condiciones favorables para la polimerización con una polimerasa con actividad de 5nucleasa; y (c) controlar en continuo la amplificación controlando la fluorescencia producida al tener lugar la hibridación del conjugado con la diana amplificada y la segmentación mediante la actividad de 5-nucleasa. 3. Un método para detectar una secuencia diana en un polinucleótido, en el que el polinucleótido está presente en una mezcla de otros polinucleótidos, y en el que uno o más de los otros polinucleótidos de la mezcla comprenden secuencias que están relacionadas pero que no son idénticas a la secuencia diana, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la mezcla de polinucleótidos con un conjugado de oligonucleótido que tiene la fórmula: en la que MB es un ligando del surco menor, n es 0 o 1, uno de los grupos Fl A y Fl B es un fluoróforo y el otro de los grupos Fl A y Fl B es un apagador, W es un grupo de enlace trivalente, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, K es una unión o un grupo de enlace; teniendo la secuencia de ODN un solapamiento de 1 a 7 bases con una secuencia de cebador de al menos un cebador de amplificación de la secuencia diana, en donde el conjugado forma un híbrido estable solamente con dicha secuencia diana que es perfectamente complementaria para la porción de ODN de dicho conjugado, y el conjugado no forma un híbrido estable con ninguno de los otros polinucleótidos; y (b) medir la fluorescencia producida en la formación del híbrido, con lo que la formación del híbrido indica la presencia de dicha secuencia diana. 4. Un método para detectar entre polinucleótidos de tipo silvestre, mutantes y heterocigóticos, comprendiendo el método: (a) poner en contacto una muestra que contiene un polinucleótido diana con dos sondas en las que una primera sonda es específica para el polinucleótido diana de tipo silvestre y una segunda sonda es específica para el polinucleótido diana mutante, teniendo cada una de las sondas la formula: en la que MB es un ligando del surco menor, n es 0 o 1, uno de los grupos Fl A y Fl B es un fluoróforo y el otro de los grupos Fl A y Fl B es un apagador, W es un grupo de enlace trivalente, ODN es un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, K es una unión o un grupo de enlace; teniendo la secuencia de ODN un solapamiento de 1 a 7 bases 10 con una secuencia de cebador de al menos un cebador de amplificación del polinucleótido diana; en donde la primera y la segunda sondas tienen fluoróforos diferentes y cada una de las sondas forma un híbrido estable solamente con la secuencia diana que es perfectamente complementaria con la porción de ODN de la sonda; y ES 2 365 737 T3 (b) medir la fluorescencia producida en la formación del híbrido, con lo que la formación del híbrido indica la presencia o ausencia de cada uno de los polinucleótidos diana de tipo silvestre, mutante y heterocigótico. 21 ES 2 365 737 T3 1/3 Figura 1 Figura 1: a) y b) muestran una representación esquemática de la situación de cebador y sonda en la diana, con una secuencia de cebador solapada con una secuencia de sonda; c) muestra una representación esquemática de dos secuencias de cebador solapadas; d) muestra una representación esquemática de una secuencia de sonda solapada con ambos cebadores. Figura 2 Figura 2: Los cebadores y sondas con secuencias solapadas que se muestran en la Tabla I fueron usados en el ensayo MGB Eclipse. 22 ES 2 365 737 T3 Figura 3 Figura 3. Una titulación por amplificación por PCR de virus BK a partir de 10 3 a 10 7 copias. Se usaron las condiciones estándar del ensayo con sonda MGB Eclipse. Figura 4 Figura 4. Tipaje del polimorfismo por curva de fusión post-amplificación por PCR del polimorfismo de MMP-3 en 102 muestras de DNA. 23 ES 2 365 737 T3 3/3 Figura 5 24