PROCESADO DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS: PREPARACIÓN DE MICROPARTÍCULAS DE PROTEÍNA Y SU ESTABILIZACIÓN.

Procesado de fluidos supercríticos: preparación de micropartículas de proteína y su estabilización. Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para la precipitación de proteínas y polipéptidos por procesado con fluido supercrítico y a su protección y estabilización frente a la desnaturalización. Antecedentes de la invención La necesidad de proteínas y polipéptidos estables para muchas aplicaciones está aumentando continuamente. Esto es particularmente pronunciado para proteínas terapéuticas en el campo farmacéutico. Para la facilidad tanto de los fabricantes como de los usuarios finales las disoluciones acuosas de proteínas son a menudo la forma preferida de administración. Además esta es su forma natural común que permite la formación de complejos doblados tridimensionales hidratados. Esta conformación se denomina generalmente estructura terciaria y su integridad es de vital importancia para mantener la actividad biológica de las proteínas. La pérdida irreversible de la estructura terciaria de las proteínas se denomina desnaturalización y provoca inactivación. Debido a que las proteínas y polipéptidos en disolución están expuestos a muchas tensiones que pueden provocar la degradación física (desnaturalización) y química (es decir, reacciones tales como hidrólisis, desaminazión, etc.), muy a menudo se excluye el desarrollo de formulaciones líquidas. Actualmente, el modo más común de conseguir la estabilidad de la proteína es la retirada de agua por procedimientos apropiados tales como liofilización o secado por pulverización. Sin embargo, ambas técnicas (ref. Formulation and delivery of Proteins and Peptides J.L. Cleland and R. Langer American Chemical Society, Washington, DC, 1994) pueden incluir el desdoblamiento de la proteína. En particular con respecto a liofilización el desdoblamiento de la proteína puede ocurrir durante la etapa inicial de congelación o durante la deshidratación aguda por sublimación. En lo referente al secado por pulverización, la degradación térmica, baja eficiencia, bajo rendimiento y altos niveles de humedad residual son las principales limitaciones de la técnica. Otro problema es la diferencia de estabilidad a largo plazo de formulaciones análogas obtenidas por diferentes procedimientos de secado. De hecho, dependiendo del método de deshidratación, la proteína puede adoptar estructuras tridimensionales diferentes con la misma actividad biológica inicial pero diferente vida útil. El documento WO 00/69887 se refiere al aislamiento de una proteína de una disolución acuosa, en el que la proteína se deshidrata simultáneamente. Esto se aplica a la preparación de microcristales de proteína revestida. El efecto estabilizante de los carbohidratos y en particular de la trehalosa sobre proteínas durante la congelación y deshidratación está bien documentado (Formulation and Delivery of Proteins and Peptides J.L. Cleland and R. Langer American Chemical Society, Washington, DC 1994 and Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products L. Rey and J.C. May, Marcel Dekker, Inc. New York 1999). Aunque muchos azúcares pueden prevenir el daño a la proteína durante la deshidratación, los productos a menudo tienen una vida útil corta a temperatura ambiente debido a la reacción de Maillard. La estabilidad a temperatura ambiente se puede mejorar usando azúcares no reductores tales como sacarosa y trehalosa. La solicitud de patente británica GB 2009198 describe la liofilización de polisacárido meningocócico y trehalosa; el documento GB2126588 describe la estabilización de factor de necrosis tumoral (TNF) por liofilización y congelación incluyendo un tensioactivo no iónico o trehalosa (u otro azúcar); y la solicitud de patente japonesa J 58074696 describe la liofilización de ATP en presencia de trehalosa. Se dice que las preparaciones de fosfatasa alcalina que contienen trehalosa mantienen su actividad después de la liofilización y mantienen alrededor de 70% de la actividad inicial después de 84 días de almacenamiento a 45ºC (A.W: Ford et al., J. Pharm. Pharmacol. 1993, 45: 86-93). Aunque la liofilización es aún el principal procedimiento usado para secar proteínas, se deben tomar varias precauciones para evitar el daño que pueden provocar las fases de tensión severa tales como congelación-descongelación y secado. De hecho, durante la primera etapa en la formulación de proteínas liofilizadas, una correcta elección de las condiciones (pH, fuerza iónica, presencia de estabilizantes, etc.) garantiza la mejor protección contra el desdoblamiento de proteínas y la inactivación. Se sabe que muchos excipientes tales como azúcares, aminoácidos, polímeros, ligandos específicos de tensioactivos (substratos, cofactores, modificadores alostéricos, etc.) estabilizan proteínas durante la liofilización y han sido denominados lioprotectores. Entre ellos, han sido muy estudiados carbohidratos y en particular disacáridos tales como sacarosa y trehalosa. El mecanismo de estabilización de estos compuestos así como de otros estabilizantes no se ha clarificado completamente. Sin embargo, un lioprotector efectivo debe mantener la estabilidad tanto durante la congelación-descongelación como durante el secado. Dado que el medio de la proteína es acuoso durante mucha parte del procedimiento de congelación, los solutos que estabilizan la conformación nativa en disoluciones acuosas son muy a menudo efectivos como crioprotectores de proteínas. Son ejemplos los carbohidratos y algunos aminoácidos. Arakawa et al. (J. Pharm. Res. 1991, 8, 285-291) publicaron que tales solutos tienden a ser excluidos de la superficie de la proteína cuando está en disolución acuosa. La consecuencia termodinámica de tal fenómeno 2   es la estabilización de la conformación nativa de la proteína. La estabilidad durante el secado y almacenamiento se explica mejor tanto por la substitución de agua como por la hipótesis de vitrificación. La primera afirma que los estabilizantes interaccionan con la proteína como lo hace el agua remplazando al agua retirada y dan cuenta del control termodinámico del procedimiento de secado. La última afirma que los estabilizantes son buenos formadores de vidrio y permanecen amorfos durante y después del secado de modo que inmovilizan mecánicamente las proteínas dentro de una matriz vítrea. Este es un argumento puramente cinético que funciona igualmente bien tanto para la estabilidad de secado como para la de estabilidad de almacenamiento (Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products L. Rey and J. C. May, Marcel Dekker, Inc. New York 1999). Por consiguiente, refiriéndonos a la anterior hipótesis de estabilización de proteínas secas, se puede postular que la vitrificación es una de las principales cuestiones para la estabilidad a largo plazo. El uso de secado por pulverización para la desecación de proteínas ha sido menos investigado. Aunque se pueden producir partículas amorfas finas, este procedimiento requiere aire caliente como fuerza de secado que puede conducir a la degradación térmica de la proteína. Además, otras limitaciones son la baja eficiencia, bajo rendimiento y altos niveles de humedad residual. Otra técnica publicada para secar proteínas que debería evitar la inactivación es la deshidratación al aire a temperatura ambiente. El documento US 4.891.319 de Quadrant Bioresources Ltd (UK) describe la conservación de varias proteínas y otras macromoléculas a 37-40ºC secando en presencia de trehalosa a presión atmosférica. El documento US 5874029 describe un método y aparato para la producción de micro y nanopartículas, usando un fluido supercrítico en gotas atomizadas para eliminar el disolvente y producir partículas. Se usa un procedimiento GAS. El uso de tecnología de fluido supercrítico se ha citado también como método útil para obtener proteínas en forma de micropartículas finas secas. Las principales ventajas de esta técnica son la posibilidad de mantener la proteína en un medio acuoso favorable antes de una rápida precipitación para minimizar la desnaturalización y la duración del procedimiento que es más corta que la liofilización y menos cara. Jung et al. han revisado el diseño de partículas usando fluidos supercríticos en su artículo (J. Supercritical Fluids, 20 (2001), pp. 179-219). S.P. Sellers et al. (J. Pharm. Sci., 2001, 90, 785-797) publican un método de deshidratación para la producción de polvo de proteína basado en la nebulización asistida por CO2 supercrítico. Esta técnica se puede asimilar a secado por pulverización; de hecho se usa CO2 supercrítico para mejorar la nebulización de la disolución y no como antidisolvente para la precipitación de soluto. El procedimiento GAS (recristalización en gas antidisolvente) para formar micropartículas de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la coprecipitación de una proteína o polipéptido con un estabilizante para ellos, por medio de un procedimiento de gas antidisolvente que comprende introducir en un recipiente de formación de partículas un fluido supercrítico mezclado con un modificador; y una disolución que comprende dicha proteína o polipéptido y dicho estabilizante disuelto en un disolvente; de modo que dicho disolvente se extrae de la disolución por medio de dicho fluido supercrítico y ocurre la coprecipitación de la substancia y el estabilizante, en el que dicho estabilizante es trehalosa, dicho disolvente es agua, dicho fluido supercrítico es dióxido de carbono y dicho modificador se selecciona de metanol, etanol e isopropanol. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la substancia es una proteína. 3. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha disolución y dicho fluido supercrítico se introducen en dicho recipiente de formación de partículas vía boquillas de entrada separadas. 4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho fluido supercrítico se introduce en dicho recipiente de formación de partículas vía una pluralidad de boquillas de entrada. 5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que dichas boquillas están presentes en un disco, estando la boquilla de entrada de disolución en el centro de dicho disco rodeada por una pluralidad de boquillas de entrada de fluido supercrítico uniformemente distribuidas a lo largo de su circunferencia. 6. Un procedimiento según la reivindicación 1 a 5, en el que la disolución se introduce en el recipiente de formación de partículas mezclada con un modificador. 7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el modificador es etanol. 8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la relación de proteína o polipéptido a estabilizante en la disolución es 1:1 a 10 peso/peso. 9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la relación de proteína o polipéptido a estabilizante en la disolución es 1:2 peso/peso. 10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el fluido supercrítico entra en el recipiente de formación de partículas a la velocidad del sonido en el fluido o mayor. 11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se usa un modificador y la relación entre el caudal de fluido supercrítico y el caudal de modificador está dentro del intervalo de 4:1 a 8:1 peso/peso. 12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se usa un modificador y la relación entre el caudal del modificador y el caudal de la disolución está dentro del intervalo de 15:1 a 25:1 peso/peso. 12   13   14     16   17   18   19