PROCEDIMIENTO Y KIT DE ANÁLISIS PARA LA SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN Y RECUPERACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE CADENA LARGA Y DE CADENA CORTA.

Procedimiento para la separación, purificación y recuperación de ácidos nucleicos de cadena larga y / o corta con los siguientes pasos:

- Unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida por medio de un tampón de unión - Elución de los ácidos nucleicos unidos de la fase sólida, caracterizado porque el tampón de unión a) comprende como componente activo una composición de al menos una sal del ácido cítrico con cationes de carga positiva simple y b) al menos un alcohol, y c) no contiene ni sales caotrópicas ni una combinación de sales con cationes mono y polivalentes, y d) porque las fuerzas iónicas para la unión a la fase sólida en combinación con un alcohol son inferiores a 100 mM

Procedimiento y kit de análisis para la separación, purificación y recuperación de ácidos nucleicos de cadena larga y de cadena corta

La invención se refiere a una novedosa fórmula de tampón para la rápida separación, purificación y altamente eficiente recuperación de ácidos nucleicos de cadena larga y / o de cadena corta.

La invención se centra especialmente en aquellas aplicaciones en las que se deben purificar y recuperar de forma altamente eficiente y rápida fragmentos específicos de ácidos nucleicos a partir de mezclas de reacción complejas (PCR, mezclas de restricción, mezclas de secuenciación, mezclas de marcación) , para añadirlos a una reacción posterior.

Para la purificación y la recuperación de fragmentos específicos de ADN existe en la actualidad un sinnúmero de kits disponibles en el mercado.

Todos estos procedimientos se basan en un procedimiento desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El procedimiento combina la disolución de la agarosa que contiene la banda de ADN que ha de ser aislada, en una solución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con la unión de ADN a partículas de vidrio. A continuación se lava el ADN fijado a las partículas de vidrio con una solución de lavado (Tris HCl 20 mM [pH 7, 2]; NaCl 200 mM; EDTA 2 mM; 50 % v/v de etanol) y, por último, se separa de las partículas de soporte.

El principio físico-químico de los sistemas que actualmente se encuentran disponibles en el mercado y que se usan según el estado conocido de la técnica para el aislamiento de ácidos nucleicos en base a la unión de los ácidos nucleicos a las superficies de soportes minerales deberá consistir en la alteración de estructuras superiores del medio acuoso, por medio de la cual se adsorben los ácidos nucleicos a la superficie de los materiales minerales, especialmente de partículas de vidrio o silicato. La alteración de las estructuras superiores del medio acuoso tiene lugar siempre en presencia de iones caotrópicos y a altas concentraciones de éstos es casi cuantitativa. A partir de la base físico-química descrita, todos los sistemas disponibles en el mercado para el aislamiento de ácidos nucleicos contienen composiciones de tampón con sales caotrópicas de alta fuerza iónica, para la unión de ácidos nucleicos a una fase sólida que une ácidos nucleicos.

Todos los procedimientos descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos a través de la unión de los ácidos nucleicos a fases minerales sólidas mediante el uso de soluciones salinas caotrópicas tienen en común que se tengan que utilizar altas concentraciones para la unión de los ácidos nucleicos con los materiales de soporte empleados. Además, precisamente las sales caotrópicas (p. ej. isotiocianato de guanidina, clorhidrato de guanidina, perclorato de sodio o yoduro de sodio) son sustancias que reaccionan de un modo altamente tóxico. Los sistemas de tampón usados con fuerzas iónicas muy altas producen a menudo la transmisión de contaminaciones salinas, lo que puede resultar problemático para una serie de aplicaciones posteriores. Por otra parte, existe un notable riesgo para la salud a la hora de manejar tampones caotrópicos (especialmente en el caso de aplicaciones durante largos periodos de tiempo) , así como una considerable contaminación del medio ambiente debido a la carga de sustancias nocivas contenida en las aguas residuales.

Curiosamente, se ha demostrado que todos los sistemas disponibles en el mercado a nivel mundial para el aislamiento de ácidos nucleicos que se basan en la unión de ácidos nucleicos con materiales minerales de soporte (partículas magnéticas, membranas, suspensiones portadoras, entre otros) , actúan principalmente de acuerdo con el procedimiento descrito. Desde la primera descripción por parte de Vogelstein y Gillespie, los ácidos nucleicos unidos se lavan siempre con alcohol o con soluciones salinas que contienen acetona. Los pasos de lavado constituyen una parte esencial de los protocolos de extracción y sirven siempre, además de para la eliminación de las sustancias inhibidoras no deseadas que se han unido, para la eliminación necesaria de las sales que se precisan para la unión de los ácidos nucleicos.

En el documento de patente WO 01/62976 A1 se da a conocer un procedimiento que abarca la purificación de ácidos nucleicos a partir de distintas mezclas de reacción por adición de diferentes alcoholes, su posterior precipitación en fases sólidas especiales (membranas con características físicas específicas) , los pasos de lavado con tampones alcohólicos y la elución final de los ácidos nucleicos por medio de agua.

Asimismo, los documentos de patente US 54055951 A y EP 0512767 A1 describen el aislamiento de ácidos nucleicos mediante la incubación de la muestra que contiene ácidos nucleicos con un alcohol y la posterior incubación de la muestra con un material mineral. La elución de los ácidos nucleicos tiene lugar a través de la adición de agua calentada a 60 ºC.

En el documento de patente DE 10253351 A1 se da a conocer que la purificación y la recuperación de ácidos nucleicos se produce debido a que la solución que contiene ácidos nucleicos se regula de tal modo que contenga cationes monovalentes y polivalentes, así como un alcohol, que se ponga a continuación en contacto con la fase sólida, se lave el soporte, en caso necesario, y se desprenda el ácido nucleico de la fase sólida. Como componentes salinos monovalentes se emplea el cloruro de amonio, cloruro de sodio y/o cloruro de potasio; y como componente salino polivalente, el cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de zinc y/o cloruro de manganeso.

Se da a conocer que precisamente la combinación de una sal monovalente y de una polivalente conduce a que los ácidos nucleicos se adsorban a las fases sólidas, para lo cual basta con que las fuerzas iónicas requeridas sean muy reducidas. Esto tiene la ventaja de que, en su caso, los pasos de lavado que hasta el momento siempre habían sido necesarios dejarán de serlo, por lo que los procedimientos de aislamiento de los ácidos nucleicos se reducen y se simplifican notablemente.

No obstante, queda demostrado que con el empleo de las combinaciones de tampones indicadas en el documento de patente DE 10253351 A1 (p. ej. cloruro de magnesio / cloruro de potasio) , si bien la purificación y la recuperación de fragmentos de ADN a partir de mezclas de reacción de PCR tiene lugar con un alto índice de recuperación, lamentablemente no es posible llevar a cabo la eliminación selectiva de subproductos no deseados de la PCR (p. ej. dímeros de cebadores) .

Con esto únicamente es posible demostrar la posibilidad general de la recuperación de fragmentos de ADN, aunque no así su eficiente purificación. Parece que el motivo de esta observación posiblemente sea el catión polivalente empleado. No obstante, en el caso de que el catión polivalente se elimine de la mezcla de tampones, ya no es entonces posible la recuperación de los ácidos nucleicos con los tampones descritos basados en la reducida fuerza iónica. Pero precisamente el uso de tampones con una fuerza iónica muy reducida ha constituido la disposición conforme a la invención del documento de patente.

El documento WO00/34463 A1 describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos se unen a una fase sólida, para lo que la unión es mediada por tampones de unión basados en las denominadas sales anticaotrópicas y en un componente alcohólico. Los ácidos nucleicos unidos se lavan con tampones de lavado conocidos en sí y finalmente se eluyen mediante la adición de un tampón con bajo contenido en sal. Las fuerzas iónicas de las denominadas sales anticaotrópicas son de al menos 0, 1 M – 10 M. Las denominadas sales anticaotrópicas para la unión de ácidos nucleicos con una fase sólida son, sin excepción, cloruros.

El documento de patente WO 89/08257 A1 indica que los citratos están incluidos en la categoría de las sales anticaotrópicas. La cualidad caracterizada en este documento se entiende en el contexto de la inmovilización de proteínas y no tiene ninguna relación con los ácidos nucleicos o procedimientos para el aislamiento y la purificación de los ácidos nucleicos.

El documento de patente W02005058933 A describe un procedimiento para el aislamiento de ARN a partir de una muestra biológica... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la separación, purificación y recuperación de ácidos nucleicos de cadena larga y / o corta con los siguientes pasos:

• Unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida por medio de un tampón de unión

• Elución de los ácidos nucleicos unidos de la fase sólida,

caracterizado porque el tampón de unión a) comprende como componente activo una composición de al menos una sal del ácido cítrico con cationes de carga positiva simple y b) al menos un alcohol, y c) no contiene ni sales caotrópicas ni una combinación de sales con cationes mono y polivalentes, y d) porque las fuerzas iónicas para la unión a la fase sólida en combinación con un alcohol son inferiores a 100 mM.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las sales del ácido cítrico representan sales con cationes de carga positiva simple.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque como sales del ácido cítrico se emplean hidrogenocitratos o dihidrogenocitratos.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque se emplean las siguientes sales:

a) hidrogenocitrato de diamonio y / o b) dihidrogenocitrato de amonio y / o c) citrato de trisodio y / o d) hidrogenocitrato de disodio y / o e) dihidrogenocitrato de sodio y / o f) citrato de tripotasio y / o g) hidrogenocitrato de dipotasio y / o h) dihidrogenocitrato de potasio.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las concentraciones de alcohol de los tampones de unión oscilan entre un 20 % y un 90 %.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque las concentraciones de alcohol de los tampones de unión oscilan entre un 40 % y un 70 %.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque como alcoholes se emplean el metanol, el etanol, el propanol, el isopropanol, el etilenglicol, el polietilenglicol o el glicerol.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las fuerzas iónicas para la unión a la fase sólida en combinación con un alcohol se encuentran por debajo de 50 mM.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como fase sólida se emplean materiales de fibras de vidrio, geles de sílice, suspensiones de soportes minerales, partículas magnetizadas; preferiblemente materiales de fibra de vidrio de 0, 7 μm a 2 μm.

10. Procedimiento para la separación y recuperación de ácidos nucleicos de cadena larga y / o corta, caracterizado por los siguientes pasos:

• Adición de los tampones de unión según una de las reivindicaciones 1 a 8 a las mezclas de reacción que contengan ácidos nucleicos

• Traslado de la mezcla formada por las mezclas de reacción y los tampones de unión a una fase sólida

• Elución de los ácidos nucleicos unidos a la fase sólida.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se prescinde del lavado de los ácidos nucleicos unidos a la fase sólida.

12. Uso del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 11 para la purificación de productos de la PCR, mezclas de restricción o mezclas de secuenciación.