Sistema móvil de test rápido para análisis de ácido nucleico.

Sistema móvil de test rápido para análisis de ácido nucleico en forma de un equipo manual a hacer funcionar de forma móvil,

que durante el funcionamiento no necesita de ninguna fuente de tensión externa, que comprende un dispositivo para la amplificación e hibridización de ácidos nucleicos así como un kit de ensayo para la comprobación del suceso de amplificación, en donde el dispositivo comprende una cavidad de reacción para la realización de una amplificación de ácidos nucleicos mediante la tecnología de PCR rápido, uno o varios orificios de entrada o de salida para la cavidad de reacción, uno o varios bloques de muestra calefactables que están unidos con cuerpos miniaturizados de refrigeración y una posibilidad para la lectura del resultado, caracterizado porque:

a) Los bloques de muestra calefactables están realizados de forma convexa y las superficies no calentadas son entre 1,4 y 1,9 veces más grandes que las superficies calentadas;

b) La cavidad de reacción contiene una lámina de plástico con un grosor de lámina que es menor que 300 μm, y

c) La comprobación del suceso de amplificación se realiza mediante una tira de ensayo de flujo lateral.

Sistema móvil de test rápido para análisis de ácido nucleico.

El objeto de la invención es un sistema de equipo móvil para el diagnóstico genético.

Estado de la técnica

La investigación de muestras biológicas relevantes para el diagnóstico tales como suero, plasma, sangre, muestras 1 de frotis o raspado de órganos para la comprobación de agentes patógenos infecciosos ha aumentado enormemente su importancia en los últimos años. Infecciones víricas tales como VIH, VCH o VHB están extendidas a nivel mundial. Además de ello, también están nuevamente extendidas infecciones bacterianas, entre otras, también como resultado de los cambios climáticos que están comenzando. La aparición de nuevas enfermedades infecciosas mortales con un elevado potencial de infección (SARS, gripe aviar) demuestra de una forma cada vez 15 más evidente que un diagnóstico rápido y que se pueda realizar in situ será decisivo para evitar epidemias. Además de ello, sistemas de diagnóstico fácilmente manejables y relativamente económicos, en particular para los países en desarrollo, juegan también un papel cada vez más importante para combatir la propagación de enfermedades infecciosas. Los test empleados en la actualidad principalmente para la detección de enfermedades víricas infecciosas (VIH, VCH, VHB) se basan en su mayoría también en la realización de PCRs en tiempo real. Estos test 2 están asociados a requisitos técnicos de equipos extremadamente caros así como a reactivos también caros. La realización de estos métodos sólo se puede desarrollar por personal experto formado en laboratorios especiales. No es posible un diagnóstico in situ. Nuevas generaciones de soluciones de sistemas integrativos (combinación de aislamiento de ácido nucleico, amplificación y detección con chip) para un diagnóstico móvil in situ se encuentran en desarrollo, pero no en un estado de precomercialización con éxito. Además de ello, estos sistemas se centran 25 también a menudo en el ámbito del diagnóstico militar y son también muy caros en comparación con los procedimientos clásicos de PCR en tiempo real, tanto en lo que se refiere a equipos como a reactivos.

La denominada tecnología PCR rápida permite la realización de reacciones de amplificación en el transcurso de tan sólo unos pocos minutos y es con ello claramente más rápida que un procedimiento PCR estándar. Para la solución 3 de equipo miniaturizada, la invención se resuelve mediante una actividad reactiva novedosa (consumible). En el ámbito de los consumibles PCR se conocen diferentes métodos para su fabricación. El procedimiento de fabricación más extendido es el moldeo por inyección. Los consumibles así fabricados es encuentran comercialmente disponibles en una pluralidad de formas y disposiciones. Sin embargo, todos estos recipientes presentan un espesor de pared muy grueso (aprox. ,2 mm - ,35 mm), lo que representa una resistencia muy importante para una buena 35 transmisión térmica, desde el bloque de muestra calentado a la muestra. Si se emplean estos recipientes en un termociclador conforme a su uso, el bloque de muestra que se encuentra en los equipos se calienta con una velocidad de hasta 5°C/s. Sin embargo, la velocidad resultante en la muestra se reduce notablemente debido a los recipientes, de tal forma que la muestra (que se encuentra en el recipiente) sólo se calienta con aprox. 1,5-2 °C/s. Incluso recipientes ofrecidos como de pared fina (mínimo grosor de pared de aproximadamente ,19 mm; catálogo 4 de productos de Eppendorf 7-8, pág. 2) no permiten mejorar este estado de forma notable. Los requisitos técnicos (calentar y enfriar) para un proceso rápido de las temperaturas en el PCR están técnicamente realizados, pero se ven muy perjudicados en su eficacia debido al consumible empleado.

Los volúmenes de muestra empleados habitualmente en el PCR se encuentran comprendidos en el intervalo de 5-5 45 pl. Los recipientes fabricados mediante moldeo por inyección presentan en el suelo su máximo grosor de pared, de tal forma que un temperado y la realización de una reacción PCR de pequeños volúmenes 1-1 pl (que se acumulan en el fondo de los recipientes) sólo se puede realizar lentamente y de forma muy imprecisa.

Los bloques de muestra metálicos empleados (aluminio, plata) en termocicladores con gran capacidad térmica 5 hacen también que sea imposible realizar rápidos cambios de temperatura en la muestra incluso cuando se utilizan potentes elementos de calefacción. La rapidez de sistemas existentes en el mercado, que trabajan sobre la base de bloques de muestra metálicos y consumibles de moldeo por inyección, choca de este modo contra límites objetivos. De ello se deduce que debido a su enorme ineficacia térmica, variantes miniaturizadas, móviles de estos termocicladores superan de forma desmedida la capacidad de potencia eléctrica de la tecnología de baterías actual. 55

Otros sistemas estacionarios se basan en una tecnología avanzada para aumentar la eficacia térmica y hacer

posible un PCR rápido.

Como sistema PCR rápido comercialmente disponible más conocido se debe de mencionar aquí el LightCycler de

Roche Molecular Blochemlcals (cat. n.° 199339 y cat. n.° 211468). Este sistema se basa en el uso de capilares de vidrio muy delgados como consumibles PCR y da lugar a una temperlzaclón mediante aire caliente, que circula por los capilares. Estos capilares pueden absorber un volumen de 1-2 pl y se caracterizan por su gran superficie que hace posible una buena transmisión térmica. Sin embargo, esta gran superficie de vidrio absorbe componentes de 5 restos de PCR estándar y permite de este modo que la reacción sea más inactiva. Para compensar este efecto se tienen que emplear, por ejemplo, diferentes moléculas portadoras, etc. (documento EP113359). Otro inconveniente viene dado también por el manejo de los capilares muy finos y su precio. Sin embargo, continúa siendo imposible una miniaturización y un manejo sencillo de los recipientes.

En el documento US25/227275 A1 se describe una tecnología que no se basa en consumibles estándar y que se puede aprovechar para el uso móvil. Aquí se introduce un tejido metálico mediante técnica de producción en una pared de la cámara de reacción PCR. Éste proporciona una transmisión térmica directa a la muestra. A pesar de que se indica que la pared tiene que ser delgada, no se indica cómo de delgada tiene que ser. Al mismo tiempo, no se hace referencia alguna al enfriamiento de la muestra. Con ello, si bien este documento explica que se tiene que 15 realizar un PCR rápido, sólo entra de forma insuficiente en la conversión técnica. Bajo este punto, también se encuentra el hecho de que el consumible ahí descrito no es conforme a la necesidad de ser un material de consumo económico. La introducción de un tejido calefactor definido y un dispositivo para el control de la temperatura se oponen a este requisito. El objeto de acuerdo con la invención de esta publicación US25/227275 A1 es también la realización de una reacción PCR y una comprobación de productos de amplificación mediante una tira de flujo 2 lateral. Se describe un PCR con nucleótidos y primarios marcados (reivindicación 1, figuras 1, 2, 3, 4, 6). Sin embargo, resulta inconveniente en este procedimiento que el producto PCR no se hibridice con una sonda marcada. La única comprobación de un producto de amplificación por esta vía es sin embargo muy insegura desde un punto de vista de diagnóstico, dado que no está garantizada la especificidad del producto de amplificación requerida al 1%. Para ello necesita de una reacción de hibridización específica. Además de ello, existe el peligro latente de 25 que aparezcan resultados de falsos positivos debido a mispriming y dímeros de primer.

El uso de un diseño similar al de un chip para el alojamiento de una cámara PCR no representa un nivel inventivo debido a sus múltiples citas en la literatura de patentes. Más bien, la conformación de un mecanismo de calefacción/enfriamiento, la transmisión térmica global, la adición de componentes reactivos bioquímicos 3 líquidos/sólidos y la conversión del mando de los parámetros de proceso representan una novedad. De este modo, por ejemplo, el documento WO 27/92713 A2 se ocupa de un diseño de consumible en forma de chip que puede comprender también una cámara PCR además de clasificación celular y comprobación de proteínas inmunológicas. Mediante un procedimiento de tira de ensayo de flujo lateral se separan y discriminan diferentes tipos de células (precursoras de células de cáncer y células de cáncer) con la ayuda de anticuerpos correspondientes. Sin embargo, 35 el procedimiento de flujo lateral no sirve para la comprobación de sucesos de amplificación.... [Seguir leyendo]

1. Sistema móvil de test rápido para análisis de ácido nucleico en forma de un equipo manual a hacer funcionar de forma móvil, que durante el funcionamiento no necesita de ninguna fuente de tensión externa, que

comprende un dispositivo para la amplificación e hibridización de ácidos nucleicos así como un kit de ensayo para la comprobación del suceso de amplificación, en donde el dispositivo comprende una cavidad de reacción para la realización de una amplificación de ácidos nucleicos mediante la tecnología de PCR rápido, uno o varios orificios de entrada o de salida para la cavidad de reacción, uno o varios bloques de muestra calefactables que están unidos con cuerpos miniaturizados de refrigeración y una posibilidad para la lectura del resultado, caracterizado porque:

a) Los bloques de muestra calefactables están realizados de forma convexa y las superficies no calentadas son entre 1,4 y 1,9 veces más grandes que las superficies calentadas;

b) La cavidad de reacción contiene una lámina de plástico con un grosor de lámina que es menor que 3 pm, y

c) La comprobación del suceso de amplificación se realiza mediante una tira de ensayo de flujo lateral.

2. Sistema móvil de test rápido según la reivindicación 1, caracterizado porque en los bloques de muestra calefactables las superficies no calentadas son 1,7 veces más grandes que las superficies calentadas.

3. Sistema móvil de test rápido según la reivindicación 1, caracterizado porque la cavidad de reacción 2 contiene una lámina de plástico con un grosor de lámina que es menor que 1 pm.

4. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el dispositivo y el kit de ensayo son componentes integrados del sistema móvil de test rápido y este sistema funciona mediante una batería o un acumulador.

5. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque cada tira de ensayo de flujo lateral contiene una zona para el acoplamiento de marcas.

6. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la lámina 3 de plástico está formada por polipropileno y se sella en una geometría deseada con estabilidad de forma y se

presiona desde arriba con una ligera presión contra el bloque de muestra.

7. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la cavidad de reacción y la tira de ensayo están dispuestas en un cartucho de reacción y porque la lámina de plástico

genera unos canales de unión con el cartucho de reacción.

8. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende además un depósito y un orificio de salida para un tampón de migración.

9. Sistema móvil de test rápido según la reivindicación 8, caracterizado porque contiene unos canales

de unión que se pueden cerrar entre la cavidad de reacción, la tira de ensayo y el depósito del tampón de migración.

1. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la actividad de reacción contiene dos superficies, que se pueden unir entre sí en unión no positiva y/o positiva a bordes

de canal o de cámara, en donde al menos una de estas superficies está formada por un material plástico o elásticamente deformable.

11. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado porque la cavidad de reacción contiene un ahondamiento.

12. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado porque la cavidad de reacción contiene émbolos móviles y cilindros huecos correspondientes para el almacenamiento de reactantes.

13. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el

bloque de muestra calefactable, que está unido con un cuerpo miniaturizado de refrigeración, representa un elemento Peltier que funciona con batería, mediante el cual es posible una tasa de calentamiento de hasta 15 °C/s.

14. Sistema móvil de test rápido según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la tira

de ensayo de flujo lateral porta dos puntos de unión separados, un punto de estreptadivina para el acoplamiento de los productos de amplificación marcados y un punto de unión para el control de funcionamiento de la tira de ensayo, así como una zona con partículas de comprobación conjugadas, preferentemente partículas de oro anti-FITC.