PROCEDIMIENTO Y FORMULACIÓN PARA LA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE CUALQUIER MATERIAL DE PARTIDA COMPLEJO.

Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos,

que comprende los pasos siguientes: · Digestión del material de partida con un tampón que no contiene componentes caotrópicos ni anticaotrópicos. · Adición de una mezcla formada por un alcohol y un detergente, ascendiendo la proporción del componente alcohólico en la mezcla de alcohol y detergente a entre 20 y 80%, y la proporción del detergente, a al menos 10%. · Unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida. · Lavado de los ácidos nucleicos unidos con tampón de lavado. · Elución de los ácidos nucleicos unidos con un tampón de baja concentración salina o con agua

El objeto de la invención es un procedimiento universal y muy simplificado, así como una formulación, para aislar ácidos nucleicos a partir de los más diversos materiales de partida con contenido en ácidos nucleicos, el cual garantiza una muy alta calidad de los ácidos nucleicos que se han de aislar y permite aislar cantidades cuantitativas. 5

En condiciones clásicas, el aislamiento de ADN a partir de células y tejidos se lleva a cabo digiriendo los materiales de partida que contienen ácidos nucleicos en condiciones fuertemente desnaturalizantes y reductoras, en parte también mediante el uso de enzimas que degradan proteínas, purificando las fracciones de ácido nucleico expuestas mediante pasos de extracción con fenol/ cloroformo y obteniendo los ácidos nucleicos a partir de la fase acuosa por diálisis o precipitación en etanol (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, CSH, “Molecular Cloning”). 10

Estos “procedimientos clásicos” para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células y, en particular, de tejidos consumen mucho tiempo (en parte más de 48 h), requieren un esfuerzo aparativo considerable y tampoco son realizables en condiciones reales de funcionamiento. Tales procedimientos suponen, además, un riesgo no despreciable para la salud debido a los agentes químicos usados, tales como fenol y cloroformo.

Diversos procedimientos alternativos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diferentes materiales 15 de partida biológicos permiten obviar la costosa extracción de ácidos nucleicos con fenol/ cloroformo perjudicial para la salud, así como reducir el tiempo invertido.

Todos estos procedimientos se basan en un procedimiento desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El procedimiento combina la disolución de la agarosa que contiene la 20 banda de ADN que se ha de aislar en una solución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con la unión del ADN a partículas de vidrio. El ADN fijado a las partículas de vidrio se lava a continuación con una solución de lavado (Tris HCl 20 mM [pH 7,2]; NaCl 200 mM; EDTA 2 mM; 50% v/v de etanol) y después se separa de las partículas de soporte.

Este procedimiento ha sufrido hasta la fecha una serie de modificaciones, y en la actualidad se usa para diferentes procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos de diferentes orígenes (Marko, M.A., 25 Chipperfield, R. y Birnboim, H.G., 1982, Anal. Biochem. 121, 382-387).

Hoy en día también existen a nivel mundial numerosos sistemas de reactivos, sobre todo para la purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y para el aislamiento de ADN plasmídico de lisados bacterianos, pero también para el aislamiento de ácidos nucleicos de cadena más larga (ADN genómico, ARN celular total) a partir de sangre, tejidos o también de cultivos celulares. 30

Todos estos kits disponibles en el mercado se basan en el principio bien conocido de la unión de ácidos nucleicos a soportes minerales en presencia de soluciones de diferentes sales caotrópicas, y usan como materiales de soporte suspensiones de vidrio en polvo finamente molido (por ejemplo vitrocerámica, BIO 101, La Jolla, CA), tierras de diatomeas (empresa Sigma) o también geles de sílice (Diagen, documento DE 4139664 A1).

En el documento US 5,234,809 (Boom) se presenta un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos 35 factible para un gran número de aplicaciones diferentes. En él se describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales de partida con contenido en ácidos nucleicos por incubación del material de partida con un tampón caotrópico y una fase sólida que se une a ADN. Los tampones caotrópicos realizan tanto la lisis del material de partida como la unión de los ácidos nucleicos a la fase sólida. El procedimiento es adecuado para aislar ácidos nucleicos a partir de cantidades de muestra pequeñas y, en la práctica, se usa especialmente en el campo del 40 aislamiento de ácidos nucleicos víricos.

Las modificaciones específicas de estos procedimientos están relacionadas con el uso de materiales de soporte novedosos que muestren ventajas de aplicación para planteamientos determinados (documento WO-A 95/34569).

En documentos de patente más recientes se da a conocer que para la adsorción de ácidos nucleicos a los 45 materiales silicatados usados y conocidos para el experto también se pueden usar muy eficazmente y con éxito las denominadas sales anticaotrópicas como componentes de sistemas de tampón de lisis/ de unión (documento EP 1135479 A). La ventaja de este procedimiento reside en que al suprimir el uso de sales caotrópicas, los sistemas de extracción suponen un riesgo claramente reducido para la salud. Sin embargo, para un aislamiento eficaz de ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica compleja, especialmente a fin de obtener ácidos nucleicos con un 50 rendimiento lo más alto posible, de nuevo se necesitan en el tampón de lisis elevadas concentraciones salinas (> 1,5 M). Así, el documento da a conocer que los tampones de lisis usados contienen concentraciones salinas de 1,5 M a 3 M.

En la publicación para información de solicitud de patente DE 4321904 A se describe un procedimiento por medio del cual es posible efectuar un aislamiento eficaz de ácidos nucleicos cuando se combinan tampones caotrópicos de alta concentración salina con componentes alcohólicos. Los tampones de lisis descritos en el documento DE 55

4321904 A contienen siempre concentraciones salinas entre 4 M y 8 M, y como sales se usan especialmente hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina o yoduro potásico. Es conocido que estas sales provocan la lisis del material de partida, así como una potente inactivación de las enzimas nucleolíticas. Tras la lisis del material de partida se lleva a cabo la adición de un alcohol. El documento de patente da a conocer que la adición de los componentes alcohólicos al tampón de lisis con una alta concentración salina media una unión especialmente eficaz de los ácidos 5 nucleicos a los materiales de filtro silicatados usados. El inconveniente del uso de tampones de lisis con elevadas fuerzas iónicas de las sales caotrópicas es siempre el uso tan solo limitado y también ineficaz de enzimas proteolíticas adicionales para una digestión eficaz de las muestras biológicas complejas, puesto que estas mismas enzimas son dañadas por el efecto desnaturalizante de proteínas de los tampones caotrópicos. Además se requieren a continuación extensos pasos de lavado para eliminar las altas concentraciones salinas del material de adsorción usado. El experto 10 sabe que las sales caotrópicas ejercen un efecto fuertemente inhibidor sobre un gran número de aplicaciones posteriores.

En el documento de modelo de utilidad DE 20207793 U se da a conocer otra opción para aislar ácidos nucleicos. El procedimiento describe la unión de ácidos nucleicos a minerales arcillosos en presencia de una sal de un catión polivalente. Se supone que el procedimiento se basa en la formación de un denominado puente catiónico entre el 15 ácido nucleico que se ha de aislar y los minerales arcillosos. La desorción de los ácidos nucleicos que se han de aislar no se lleva a cabo, como en los otros procedimientos conocidos, con agua o con un tampón de baja concentración salina, sino con un eluyente que contiene al menos un agente formador de complejos que es específico del catión polivalente usado en el tampón de unión. El inconveniente de la invención reside, en particular, en que los componentes formadores de complejos (EDTA; EGTA, etc.) con frecuencia inhiben fuertemente como ingredientes de tampones de 20 elución un gran número de aplicaciones posteriores. Aunque se supone, según se expone en el documento de modelo de utilidad, que el procedimiento se puede usar para la purificación de ácidos nucleicos sin el uso de sales caotrópicas, una serie de tampones de los ejemplos de realización contienen siempre sales caotrópicas (como, por ejemplo, sales de guanidina). Esto es válido para todos los ejemplos de realización que describen el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas complejas. Parece, por lo tanto, que el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras 25 complejas no se puede realizar sin sales caotrópicas.

El documento EP 0512767 A1 da a conocer un procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos, que comprende los pasos siguientes:

· Digestión del material de partida con un tampón que no contiene componentes caotrópicos ni anticaotrópicos.

· Adición de una mezcla formada por un alcohol y un detergente, ascendiendo la proporción del componente 5 alcohólico en la mezcla de alcohol y detergente a entre 20 y 80%, y la proporción del detergente, a al menos 10%.

· Unión de los ácidos nucleicos a una fase sólida.

· Lavado de los ácidos nucleicos unidos con tampón de lavado.

· Elución de los ácidos nucleicos unidos con un tampón de baja concentración salina o con agua.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proporción del componente alcohólico en la 10 mezcla formada por el alcohol y el detergente asciende a entre 45 y 55%.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se trata de un detergente no iónico.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como alcohol se usan alcoholes hidrosolubles, tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, etilenglicol, polietilenglicol o glicerol.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tampón para la digestión 15 proteolítica de muestras biológicas comprende SDS, Tris HCl y EDTA.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como fase sólida se usa cualquier material de soporte.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque como fase sólida se usan tanto superficies funcionales negativas conocidas, como membranas de nilón de carga positiva, membranas de polisulfona, membranas 20 de polietersulfona, membranas de PVDF, membranas de polímeros acrílicos, membranas de intercambio iónico, fritas de polietileno o simples papeles de filtro, materiales de fibras de vidrio, así como partículas de óxido de hierro magnéticas o partículas de silicato.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para la filtración previa y la adsorción final de los ácidos nucleicos se usa el mismo material de filtro. 25

9. Formulación para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales que contienen ácidos nucleicos, que comprende

· al menos un tampón para la digestión proteolítica de muestras biológicas que no contiene componentes caotrópicos ni anticaotrópicos,

· al menos una mezcla formada por un alcohol y un detergente, en la que la proporción del componente 30 alcohólico en la mezcla formada por el alcohol y el detergente asciende a entre 20 y 80%, y la proporción del detergente, a al menos 10%,

· al menos una fase sólida,

· tampón de lavado y de elución.

10. Formulación según la reivindicación 9, caracterizada porque la proporción del componente alcohólico en la 35 mezcla formada por el alcohol y el detergente asciende a entre 45 y 55%.

11. Formulación según la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque se trata de un detergente no iónico.

12. Formulación según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque el componente alcohólico comprende adicionalmente al menos una sal con un catión polivalente.

13. Formulación según la reivindicación 12, caracterizada porque en el caso de la sal con un catión polivalente se 40 trata de una sal con un catión de doble carga positiva.

14. Formulación según la reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque la concentración del catión polivalente no supera 1,5 mol/l.