PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO Y LA SEPARACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE CADENA SENCILLA Y DOBLE, ASÍ COMO COLUMNA DE SEPARACIÓN PARA LLEVAR A CABO EL PROCEDIMIENTO.

Procedimiento para el aislamiento y separación de ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble a partir de una muestra que contiene estos ácidos nucleicos,

en donde el ácido nucleico de cadena doble es ADN y el ácido nucleico de cadena sencilla es ARN, y los ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble son ligados a un material de soporte del cual se eluyen los ácidos nucleicos de doble cadena con una primera disolución de elución y los ácidos nucleicos de cadena sencilla se eluyen a continuación con una segunda disolución de elución, caracterizado porque la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena se lleva a cabo en presencia de al menos un ion metálico divalente en una concentración al menos tan elevada que durante la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena no se eluyen ácidos nucleicos de cadena sencilla, en donde la primera disolución de elución es un tampón con bajo contenido en sales o agua, y la segunda disolución de elución es una disolución con bajo contenido en sales o agua y en donde el al menos un ion metálico divalente se elige del grupo de los metales alcalinotérreos, y su concentración no es mayor que 200 mM

La invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento y la separación de ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble a partir de una sonda que contiene estos ácidos nucleicos, en donde el ácido nucleico de doble cadena es ADN y el ácido nucleico de cadena sencilla es ARN, y los ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble se unen a un material de soporte del que los ácidos nucleicos de doble cadena se eluyen con una primera disolución de elución y los ácidos nucleicos de cadena sencilla se eluyen a continuación con una segunda disolución de elución.

La preparación de ácidos nucleicos adquiere importancia de forma creciente. Así, ARN y ADN se requieren en laboratorios médico-analíticos, bioquímicos y que trabajan en biología molecular. Los sectores de aplicación abarcan desde la tecnología genética, medicina, veterinaria, medicina forense, biología molecular hasta bioquímica, así como desde la investigación básica hasta el diagnóstico rutinario aplicado.

Las muestras con contenidos en ácidos nucleicos se disgregan habitualmente en una primera etapa. Esto es estado conocido de la técnica y puede tener lugar, por ejemplo, de forma conocida por medios mecánicos, químicos, enzimáticos o mediante tratamiento con detergentes. A la disgregación de las células se une entonces el aislamiento de los ácidos nucleicos. Procedimientos clásicos son la centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio o la extracción con fenol. Sin embargo, estos métodos presentan una manipulación compleja, llevan tiempo o utilizan fenol tóxico, lo cual es problemático en la manipulación. Por estos motivos, en los últimos años se han abierto paso nuevos métodos para el aislamiento de ácidos nucleicos. A ellos pertenecen técnicas a base de intercambiadores de sílice y aniones. Mientras que los intercambiadores de aniones siguen representando el patrón dorado para preparaciones de ADN particularmente puras (por ejemplo para experimentos de transfección), las técnicas basadas en sílice se han aconsejado como métodos sencillos y económicos para una pluralidad de aplicaciones.

Desde los años 50 es sabido que el ADN se une de forma reversible a silicatos en presencia de sales caótropas (Sambrock, J. y Russel, D. W., 2001, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, páginas 1.62 y siguientes). Las sales determinan la destrucción de la envoltura de hidratos de los ácidos nucleicos y crean un microentorno hidrófobo. Bajo estas condiciones, los ácidos nucleicos se unen entonces a la matriz de sílice, mientras que las proteínas y otros contaminantes no se unen y se separan por lavado. Si entonces la disolución de unión es reemplazada por un tampón con bajo contenido en sales o agua, tiene lugar una rehidratación de los ácidos nucleicos los cuales se desprenden entonces voluntariamente de la matriz de sílice y pueden ser eluidos.

A la preparación de los ácidos nucleicos se unen entonces, por norma general, reacciones consecutivas tales como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR – siglas en inglés), la secuenciación, el ligamiento o un análisis de restricción. Las reacciones consecutivas requieren una determinada cantidad y, en particular, calidad en la que deben estar presentes los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos deben estar ampliamente intactos, presentarse con una elevada pureza y estar exentos de proteínas y metabolitos celulares.

Habitualmente, las condiciones de unión en el caso de preparaciones basadas en sílice están ajustadas de modo que solamente se une, a ser posible de forma selectiva, una forma de ácido nucleico (ya sea de cadena sencilla o doble) (véase el documento WO 97/30062). Para el aislamiento selectivo de ADN de doble cadena genómico se emplean, por ejemplo, sales caótropas tales como, por ejemplo, isotiocianato de guanidina, tiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidinio, perclorato de sodio o yoduro de sodio, en concentraciones de 0,1 a 10 M, y alcoholes alifáticos con 1 a 5 átomos de carbono en concentraciones de 1-90% en volumen. Otras condiciones de unión selectivas tales como disoluciones con sustancias que forman complejo con iones metálicos alcalinotérreos, y la ausencia de alcoholes son asimismo adecuadas y conocidas por el documento EP 0 743 950.

En calidad de soportes minerales sirven preferiblemente materiales porosos y no porosos tales como, por ejemplo, óxidos de metales, geles de sílice, partículas de vidrio, suspensión de vidrio en agua, cuarzo, zeolitas, tierra de diatomeas o dióxido de titanio con tamaños de partículas de 0,1 a 1.000 μm. Si se utilizan soportes porosos, entonces el tamaño de los poros asciende preferiblemente a 2 hasta 1000 μm. El material poroso o no poroso puede presentarse en forma de material suelto o estar configurado como una capa de filtro. Las capas de filtro pueden consistir en vidrio, cuarzo o material cerámico y/o en una membrana. Esta última puede estar configurada, de nuevo, a base de partículas y/o fibras de soportes minerales y tejidos. De preferencia, en calidad de soportes minerales se emplean, por ejemplo, membranas de fibras de vidrio. Preferiblemente, las capas de filtro se disponen en cuerpos huecos con una abertura de entrada y de salida.

La discriminación entre ADN de doble cadena y ácidos nucleicos de cadena sencilla, en particular ARN, puede reforzarse adicionalmente mediante disoluciones de lavado adecuadas. La elución del ADN ligado tiene lugar entonces bajo condiciones de baja salinidad o con agua.

Si debe aislarse de forma selectiva ARN, entonces se ajustan mediante el empleo de sales caótropas y alcohol, las condiciones de unión bajo las cuales ácidos nucleicos de cadena sencilla se unen cuantitativamente al soporte mineral. En este caso, es inevitable que también se una una parte de ADN genómico. Con el fin de eliminar esta contaminación, el ADN genómico se digiere habitualmente mediante DNasa. Es particularmente importante en la preparación de ARN la inactivación de RNasa, lo cual se asegura ya mediante las condiciones de lisis o se refuerza todavía mediante aditivos tales como β-mercaptoetanol. Al igual que el ADN genómico, el ARN previamente ligado y ahora liberado de contaminaciones de ADN, se eluye bajo condiciones de baja salinidad o, preferiblemente, con agua exenta de RNasa.

Para una pluralidad de investigaciones, es ahora particularmente ventajoso aislar simultáneamente tanto el ARN como también al ADN a partir del mismo material de ensayo. Así, p. ej. a partir de cantidades limitantes del material se pueden aislar los dos ácidos nucleicos. El aislamiento simultáneo permite, además, a través del ADN, el examen de genes y, a través del ARN, su expresión. El hallazgo de correlaciones entre las secuencias de ADN y la expresión de estos genes permite, p. ej., inspecciones en procesos de regulación. Es de particular importancia el aislamiento simultáneo de ADN y ARN, en particular en el examen de procesos de corte y empalme, un importante mecanismo en la regulación génica.

Un protocolo muy extendido para el aislamiento simultáneo de ADN y ARN se orienta en el método de Chomzynski (Chomzynski P.: A Reagent for the Single-Step Simultaneous Isolation of RNA, DNA and Proteins from Cell and Tissue Samples, BioTechniques 15, 532-534, 1993). En este caso, se lisan células con una disolución monofásica a base de isotiocianato de guanidina y fenol. La adición de cloroformo conduce a la formación de una segunda fase orgánica en la que se enriquecen el ADN y proteínas, mientras que el ARN se encuentra en el sobrenadante acuoso. El ADN puede separarse a partir de la fase orgánica de las proteínas mediante precipitación secuencial con etanol e isopropanol. Lo desventajoso de este método es la contaminación del ARN con ADN que hace necesario un tratamiento posterior. Es desventajoso, además, la duración de la preparación para el aislamiento simultáneo de ARN y ADN (en el caso más favorable de 3 horas), así como de la complejidad técnica de trabajo. Además, también es problemática la manipulación con el fenol tóxico.

Un planteamiento alternativo se conoce a partir de los documentos DE 195 06 887 y EP 0 880 535 (Testkit Invisorb TwinPrep DNA/RNA de la razón social Invitek GmbH). En este procedimiento, ADN genómico se une a un soporte mineral en presencia de sales caótropas, mientras que el ARN permanece en disolución. A partir de éste, se aísla seguidamente mediante extracción con fenol/cloroformo y se precipita con isopropanol. El ADN ligado se encuentra disponible después... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento y separación de ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble a partir de una muestra que contiene estos ácidos nucleicos, en donde el ácido nucleico de cadena doble es ADN y el ácido nucleico de cadena sencilla es ARN, y los ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble son ligados a un material de soporte del cual se eluyen los ácidos nucleicos de doble cadena con una primera disolución de elución y los ácidos nucleicos de cadena sencilla se eluyen a continuación con una segunda disolución de elución, caracterizado porque la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena se lleva a cabo en presencia de al menos un ion metálico divalente en una concentración al menos tan elevada que durante la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena no se eluyen ácidos nucleicos de cadena sencilla, en donde la primera disolución de elución es un tampón con bajo contenido en sales o agua, y la segunda disolución de elución es una disolución con bajo contenido en sales o agua y en donde el al menos un ion metálico divalente se elige del grupo de los metales alcalinotérreos, y su concentración no es mayor que 200 mM.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la primera disolución de elución comprende el al menos un ion metálico divalente con una concentración de al menos 1 mM.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el material de soporte se trata con una disolución de lavado después de la unión de los ácidos nucleicos y antes de la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la disolución de lavado contiene el al menos un ion metálico divalente.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque la disolución de lavado comprende un alcohol, preferiblemente un alcohol alifático con 1 a 5 átomos de carbono.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque la disolución de lavado comprende una sustancia tampón, y el valor del pH de la disolución de lavado se ajusta entre 4,5 y 9,5.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el valor del pH de la disolución de lavado se ajusta a 7.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el al menos un ion metálico divalente se presenta, en la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena en una concentración de a lo sumo 100 mM.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el al menos un ion metálico divalente se presenta en la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena en una concentración de a lo sumo 20 mM.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el al menos un ion metálico divalente es un ion calcio, ion magnesio, ion bario y/o ion estroncio.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se incorporan iones calcio en forma de sulfato de calcio.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque se incorporan iones bario en forma de sales de bario.

13. Procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque el material eluido con los ácidos nucleicos de doble cadena se trata con iones sulfato de modo que en el material eluido precipitan cationes todavía contenidos.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la primera disolución de elución comprende una sustancia tampón, y el valor del pH de la disolución de elución se ajusta entre 4,5 y 9,5.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el valor del pH de la primera disolución de elución se ajusta a 7.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque después de la elución del ácido nucleico de doble cadena y antes de la elución del ácido nucleico de cadena sencilla se lleva a cabo una digestión con ADN de posible ADN residual.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque después de la elución de los 5 ácidos nucleicos de doble cadena y antes de la elución de los ácidos nucleicos de cadena sencilla, el material de soporte se lava con un tampón de lavado alcohólico.

18. Columna de separación para llevar a cabo el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, con un material de soporte que es adecuado para la unión de ácidos nucleicos de cadena sencilla y doble, caracterizada porque la columna de separación contiene al menos una sal de metal alcalinotérreo en forma sólida, que es soluble en un tampón con bajo contenido en sales o agua y que, bajo la acción de este líquido, proporciona los iones metálicos divalentes en al menos una concentración tan elevada que durante la elución de los ácidos nucleicos de doble cadena no se eluyen ácidos nucleicos de cadena sencilla, ascendiendo la concentración en iones metálicos divalentes a al menos 1 mM y no siendo mayor que 200 mM.

15 19. Columna de separación según la reivindicación 18, caracterizada porque las sales de metales son sulfato de calcio y/o cloruro de bario.

20. Columna de separación según la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque el sólido está asociado al 20 material de soporte.

21. Columna de separación según una de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizada porque el sólido está presente en un papel de filtro.