Aparato móvil para el aislamiento de ácidos nucleicos.

Aparato portátil para el aislamiento móvil de ácidos nucleicos,

que comprende:

• al menos un bloque de muestras (1, 2) para la inserción de los recipientes de muestras

• una recepción de bloques de muestras (6) con orificios o escotaduras para la recepción de los bloques de muestras (1, 2)

• una base del aparato (7) con unidades de control electrónico para los bloques de muestras, una fuente de tensión, así como una conexión a la recepción de bloques de muestras

• un kit de test para el aislamiento de ácidos nucleicos,

caracterizado porque

a) los bloques de muestras (1, 2) están conectados con la recepción de bloques de muestras (6) y la recepción de bloques de muestras (6) con la base del aparato (7) a través de un conector enchufable o una conexión magnética, y

b) tanto los bloques de muestras (1, 2) se pueden retirar de la recepción de bloques de muestras (6), como también la recepción de bloques de muestras (6) se puede retirar de la base del aparato (7),

c) y porque un bloque de muestras comprende un módulo de separación magnético (2).

Aparato móvil para el aislamiento de ácidos nucleicos.

5 El objeto de la Invención es un sistema de aparatos móvil, que comprende un aparato portátil y un instrumental de test para el aislamiento móvil de ácidos nucleicos.

Estado de la técnica

10 El examen de muestras biológicas relevantes en el diagnóstico, como suero, plasma, sangre, muestra con torunda o frotis de órganos para la comprobación de agentes Infecciosos ha obtenido una enorme relevancia en los últimos años. Las Infecciones víricas como VIH, VHC o VHB van en aumento a nivel mundial. Además, también van en aumento de nuevo las Infecciones bacterianas, entre otros también como resultado del comienzo de los cambios climáticos. La aparición de nuevas enfermedades Infecciosas letales con un potencial de infección extremadamente 15 elevado (SARS, gripe aviar) siempre muestra más claramente que un diagnóstico realizable de forma rápida e in situ se vuelve decisivo para Impedir las epidemias. Esto también se refiere a la problemática del bioterrorismo y a una comprobación rápida ¡n sltu de agentes que se pueden usar como agentes biológicos de combate.

Para considerar estos problemas hay una serie de desarrollos que se ocupan del así denominado diagnóstico in situ. 20 En este caso se trata de aparatos que aúnan todas las etapas del diagnóstico molecular (aislamiento de ácidos nucleicos, amplificación y detección). Estos desarrollos se focalizan en el campo del diagnóstico militar y en analogía a los clásicos "procedimientos de REAL-TIME-PCR" también son muy caros, tanto desde el lado de aparatos como también de reactivos.

25 Parece realista que las etapas de la amplificación y detección son resolubles. Pero la integración de la preparación de muestras depara los mayores problemas. El motivo para ello es muy sencillo y se fundamenta en la problemática de los materiales de partida más diferentes a examinar y ante todo "problemáticos". Por consiguiente no está resuelto el problema de un aislamiento de ácidos nucleicos ¡n situ.

30 En las condiciones clásicas, el aislamiento del ADN a partir de células y tejidos tiene lugar de modo que los materiales de partida que contienen los ácidos nucleicos se disgregan en condiciones fuertemente desnaturilzantes y reductoras, en parte también usando enzimas que degradan proteínas, las fracciones de ácidos nucleicos liberadas se purifican mediante etapas de extracción con fenol y cloroformo y los ácidos nucleicos se obtienen de la fase acuosa mediante diálisis o precipitación con etanol (Sambrook, J:, Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, CSH, 35 "Molecular Clonlng". Estos "procedimientos clásicos" para el aislamiento de los ácidos nucleicos a partir de células y en particular de tejidos requieren mucho tiempo (a veces más de 48 h) y requieren un gasto considerable en aparatos. Los distintos procedimientos alternativos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diferentes materiales de partida biológicos permiten evitar la extracción de ácidos nucleicos mediante fenol y cloroformo, proceso laborioso y perjudicial para la salud, así como lograr la reducción del tiempo necesario. Todos estos 40 procedimientos se basan en un método desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El método combina la disolución de la agarosa que contiene las bandas de ADN a aislar en una disolución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con una unión del ADN a partículas de vidrio. El ADN fijado a las partículas de vidrio se lava a continuación con una disolución de lavado (Tris HCI 20 mM [pH 7,2]; NaCI 200 mM; 45 EDTA 2 mM; etanol al 50% v/v) y luego se desprende de las partículas de soporte.

Este método ha experimentado hasta ahora una serie de modificaciones y en el momento actual se aplica en distintos procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos de distintas procedencias (Marko, M.A., Chipperfield, R. y Bimboim, H.G., 1982, Anal. Bichem., 121, 382-387).

Además, hoy también existe a escala mundial una multiplicidad de sistemas de reactivos, ante todo para la purificación de los fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y para el aislamiento de ADN plasmídico a partir de lisados bacterianos, pero también para el aislamiento de ácidos nucleicos de cadenas más largas (ADN genómico, ARN total celular) a partir de sangre, tejidos o también cultivos celulares. Todos los kits disponibles 55 comercialmente se basan en el principio suficientemente conocido de la unión de los ácidos nucleicos a soportes minerales en presencia de disoluciones de distintas sales caotrópicas y usan como materiales de soporte suspensiones de polvo de vidrio finamente molido (p. ej. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), tierras de diatomeas (empresa Sigma) o también geles de sílice (Diagen, documento DE 41 39 664 A1).

Un procedimiento practicable para una multiplicidad de aplicaciones diferentes para el aislamiento de ácidos nucleicos está representada en el documento US 5,234,809 (Boom). Allí se describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de materiales de partida que contienen ácidos nucleicos mediante la incubación del material de partida con un tampón caotrópico y una fase sólida que se une al ADN. Los tampones 5 caotrópicos realizan tanto la llsls del material de partida, como también la unión de los ácidos nucleicos a la fase sólida. El procedimiento es muy apropiado para aislar los ácidos nucleicos a partir de pequeñas cantidades de muestra y encuentra una aplicación práctica especialmente en el campo del aislamiento de ácidos nucleicos víricos.

Las modificaciones específicas de estos procedimientos se refieren al uso de materiales de soporte novedosos, que 10 muestran ventajas de aplicación para determinados planteamientos (documento WO-A 95/34569). En documentos de patente mas recientes se da a conocer que para la adsorción de los ácidos nucleicos a los materiales silicatados usados y conocidos por el especialista también se pueden usar de manera muy eficiente y satisfactoria las así denominadas sales antlcaotróplcas como componente de los sistemas de tampones de lisis y de unión (documento EP 1135479). La ventaja de este procedimiento es que al evitar el uso de sales caotróplcas, los sistemas de 15 extracción suponen un riesgo considerablemente Inferior para la salud. Sin embargo, para un aislamiento eficiente de los ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica compleja, en particular con respecto a una obtención de los ácidos nucleicos con el mayor rendimiento posible, se necesitan de nuevo grandes concentraciones de sales en el tampón de lisis (> 1,5 M). Así, el documento de patente da a conocer que los tampones de lisis que se usan contienen concentraciones de sales entre 1,5 M y 3 M.

Estos pocos ejemplos del estado de la técnica clarifican que hay una multiplicidad de procedimientos sencillos para el aislamiento de ácidos nucleicos. En particular la posibilidad del aislamiento de ácidos nucleicos a través de su adsorción a materiales de soporte (materiales de fibras de vidrio en forma de filtros, suspensiones de componentes silicatados o distintos tipos de partículas magnéticas o paramagnéticas) se ha impuesto a escala mundial en las 25 rutinas de laboratorio. Pero también se conoce por el especialista que la realización de aislamientos de ácidos nucleicos, en principio de forma Independiente del tipo de la química usada, siempre está unida a un amplio equipamiento de laboratorio. Se necesitan entre otros, centrifugadoras, agitadores tipo vórtex, termomezcladores o Incubadoras, módulos de separación para partículas magnéticas y eventualmente máquinas automáticas. Para poder aislar los ácidos nucleicos también en condiciones de campo y por consiguiente con sistemas móviles, hasta 30 ahora sólo se han abierto nuevos caminos de solución que relacionan el proceso del aislamiento de ácidos nucleicos con una amplificación y detección subsiguientes. Un enfoque semejante es muy complicado y tampoco está resuelto hasta ahora en una forma universal. Además, los sistemas de aparatos semejantes se vuelven extremamente caros en la adquisición, como también con vistas a los materiales consumibles necesarios. No obstante, no hay soluciones del procedimiento sencillas y ante todo económicas y utilizables de forma universal (referido a las muestras 35 biológicas más diferentes).

La invención tuvo por tanto el objetivo de eliminar las desventajas descritas de las soluciones mencionadas en el estado de la técnica.

40 El objetivo se ha resuelto según las características de las reivindicaciones.

1. Aparato portátil para el aislamiento móvil de ácidos nucleicos, que comprende:

5 * al menos un bloque de muestras (1, 2) para la inserción de los recipientes de muestras

- una recepción de bloques de muestras (6) con orificios o escotaduras para la recepción de los bloques de muestras

(1.2)

10 - una base del aparato (7) con unidades de control electrónico para los bloques de muestras, una fuente de tensión, así como una conexión a la recepción de bloques de muestras

- un kit de test para el aislamiento de ácidos nucleicos,

15 caracterizado porque

a) los bloques de muestras (1, 2) están conectados con la recepción de bloques de muestras (6) y la recepción de bloques de muestras (6) con la base del aparato (7) a través de un conector enchufable o una conexión magnética, y

20 b) tanto los bloques de muestras (1, 2) se pueden retirar de la recepción de bloques de muestras (6), como también la recepción de bloques de muestras (6) se puede retirar de la base del aparato (7),

c) y porque un bloque de muestras comprende un módulo de separación magnético (2).

25 2. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizado porque los bloques de muestras (1, 2)

contienen al menos un módulo calefactor (3).

3. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizada porque el módulo de separación magnético (2) presenta uno o varios ¡manes.

4. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizado porque en el bloque de muestras (2) se sitúa una ventana de observación.

5. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizado porque la recepción de bloques de muestras 35 (6) contiene un dispositivo agitador o vibrador (5), así como uno o varios puntos de conexión reversibles para los

bloques intercambiables.

6. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizado porque la recepción de bloques de muestras (6) contiene un dispositivo calefactor adicional.

7. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizado porque una batería o un acumulador sirve como fuente de tensión.

8. Aparato portátil según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende 45 adicionalmente una conexión para una fuente de tensión externa.

9. Aparato portátil según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque posee las dimensiones siguientes:

50 - altura entre 6 y 10 cm, preferentemente 8 cm

- profundidad entre 2 y 4 cm, preferentemente 3 cm

- anchura entre 4 y 8 cm, preferentemente 5 cm.

10. Aparato portátil según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el módulo calefactor (1) sirve simultáneamente como módulo de separación magnético (2) y

a) porque junto a este módulo de separación magnético calefactor se sitúa una escotadura para la recepción de un

imán o

b) este módulo de separación magnético calefactor contiene un electroimán encendióle.

5 11. Aparato portátil según la reivindicación 1, caracterizado porque el instrumental de test comprende:

a) pipetas desechables (p. ej. pipetas Pasteur)

b) botella para desechos reactivos

c) suspensión con partículas magnéticas o paramagnéticas

d) recipientes de reacción

15 e) tampón de lisis, así como opcionalmente encimas proteolíticas en forma líquida o recipientes de reacción para la lisis de la muestra con formulaciones sólidas estables durante el almacenamiento en reactivos de lisis y encimas proteolíticas

f) tampón de unión

g) tampón de lavado

h) tampón de elución.

25 12. Contenedor de transporte, que contiene el aparato portátil según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Uso del aparato portátil según una de las reivindicaciones 1 a 11 para el aislamiento móvil de ácidos

nucleicos, que comprende las etapas siguientes:

30 * lisis de la muestra

* unión del ADN a partículas magnéticas

* separación de las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido 35

* lavado de las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido

* secado de las partículas magnéticas

40 * elución del ácido nucleico de las partículas magnéticas.