PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO EN PARALELO DE ÁCIDOS NUCLEICOS BICATENARIOS Y MONOCATENARIOS, ASÍ COMO PARA LA ELIMINACIÓN SELECTIVA DE ÁCIDOS NUCLEICOS BICATENARIOS DE UNA MEZCLA DE ÁCIDOS NUCLEICOS BICATENARIOS Y MONOCATENARIOS.

Procedimiento para el aislamiento en paralelo de ácidos nucleicos bi y monocatenarios,

así como para la eliminación selectiva de ácidos nucleicos bicatenarios de una mezcla de ácidos nucleicos bi y monocatenarios o de fuentes que contienen estas sustancias, caracterizado por las siguientes etapas: a) la muestra lisada u homogeneizada se ajusta en ausencia de alcohol o sustancias complejantes de iones alcalinotérreos o detergentes, dispersantes o humectantes con una disolución salina acuosa con una concentración superior a 1 M de forma que el ácido nucleico bicatenario se adsorbe a un soporte sólido, mientras que el ácido nucleico monocatenario no se adsorbe y queda en la disolución b) eliminación del soporte con el ácido nucleico adsorbido c) la disolución con el ácido nucleico monocatenario se mezcla con una disolución alcohólica con una concentración del 1 al 90% en volumen y se pone en contacto con otro soporte sólido, adsorbiéndose el ácido nucleico monocatenario a este otro soporte

La invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento eficaz y extremadamente sencillo y rentable en paralelo de ácidos nucleicos bicatenarios y monocatenarios. Por ácido nucleico bicatenario se entiende especialmente ADN genómico y por ácido nucleico monocatenario, ARN.

El aislamiento en paralelo de ADN genómico y ARN total celular de una muestra biológica está ligado hasta el momento actual a sólo unos pocos procedimientos practicables. Raha, S., Merante, F., Proteau, G. y Reed,

J.K. (GATA, 1990, 7(7): 173-177) describen un procedimiento para la separación de ADN genómico y ARN total celular mediante etapas de precipitación selectiva usando cloruro de litio. Otra posibilidad del aislamiento en paralelo de ADN y ARN usa técnicas de ultrafiltración usando un gradiente de cloruro de cesio para la peletización de ARN en combinación con posterior diálisis de ADN (Coombs, L.M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann, M., Denner, J. y Knowles, M.A.; Anal. Biochem. (1990);

Pero en este procedimiento son desventajosas las complejas etapas de preparación y el uso de grupos de sustancias altamente tóxicas y cancerígenas como cloroformo y fenol. Finalmente, el tiempo necesario es muy grande.

Un procedimiento simplificado para el aislamiento

simultáneo de ADN y ARN se da a conocer en la publicación

para información de solicitud de patente WO 97/28171 A1.

material de silicio monodisperso. A esta partícula se une el ADN genómico. A continuación, la mezcla se centrifuga. A este respecto se peletizan las partículas de silicio. El sobrenadante se transfiere a un nuevo recipiente de reacción. El material de soporte peletizado se lava a continuación con un tampón de lavado que contiene etanol y el ADN unido se eluye finalmente de nuevo del material de soporte mineral con un tampón bajo en sales. El sobrenadante restante se somete entonces de un modo clásico a una extracción con fenol/cloroformo y el ARN precipita finalmente de esta manera y se disuelve mediante agua después de las etapas de lavado.

El procedimiento es más rápido que el procedimiento anteriormente descrito. No obstante, en este procedimiento también se trabaja con grupos de sustancias altamente tóxicas y cancerígenas como cloroformo y fenol.

Otro procedimiento de separación y aislamiento de ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios se da a conocer en la memoria de patente EP 1 146 049 B1.

El procedimiento se basa en el tratamiento de una fuente que contiene ácidos nucleicos con al menos un material de soporte mineral de forma que:

1. Se aísla el ácido nucleico monocatenario ajustando las condiciones de tratamiento mediante una mezcla acuosa de sales caotrópicas y alcoholes alifáticos inferiores de forma que el ácido nucleico monocatenario se adsorbe prioritariamente a continuación a un soporte mineral, por el contrario el ácido nucleico bicatenario no se adsorbe. El ácido nucleico monocatenario unido se lava a continuación y finalmente se eluye del material de

soporte mediante un tampón bajo en sales.

2. Se aísla el ácido nucleico bicatenario ajustando las condiciones de tratamiento mediante una mezcla de sustancias complejantes de iones alcalinotérreos sin alcoholes alifáticos inferiores de forma que el ácido nucleico bicatenario se adsorbe a continuación a un soporte mineral, por el contrario el ácido nucleico monocatenario no se adsorbe. El ácido nucleico bicatenario unido se lava a continuación y finalmente se eluye del material de soporte mediante un tampón bajo en sales.

3. Se aísla el ácido nucleico bicatenario ajustando las condiciones de tratamiento mediante la presencia de un sarcosinato, pero sin alcoholes alifáticos inferiores de forma que el ácido nucleico bicatenario se adsorbe prioritariamente a continuación a un soporte mineral, por el contrario el ácido nucleico monocatenario no se adsorbe. El ácido nucleico bicatenario unido se lava a continuación y finalmente se eluye del material de soporte mediante un tampón bajo en sales.

4. Se aíslan los ácidos nucleicos bicatenarios o monocatenarios ajustando las condiciones de tratamiento mediante una mezcla acuosa de sales caotrópicas y alcoholes alifáticos inferiores de forma que ambas fracciones de ácidos nucleicos se adsorben a un soporte mineral. La separación de los ácidos nucleicos se realiza mediante una elución selectiva. A este respecto, el ácido nucleico bicatenario se eluye del material de soporte mediante una disolución de fuerza iónica reducida y alcoholes alifáticos inferiores. El ácido nucleico monocatenario restante se lava a continuación y finalmente se eluye del material de soporte mediante un tampón bajo en sales.

Alternativamente a esto, el ácido nucleico monocatenario puede eluirse selectivamente del material de soporte mediante una disolución que contiene sustancias complejantes de iones alcalinotérreos y/o sarcosinatos. A su vez, el ácido nucleico bicatenario desde ahora residual se lava a continuación y finalmente se eluye del material de soporte mediante un tampón bajo en sales.

El procedimiento es de realización sencilla y renuncia por completo al uso de fenol o cloroformo. Tampoco es necesaria una precipitación con etanol que requiere mucho tiempo.

No obstante, frecuentemente también se muestra que no se produce la selectividad del aislamiento de los ácidos nucleicos respectivos. Así, por ejemplo, un kit de extracción comercialmente ofertado para aislar ARN basándose en uno de los procedimientos descritos siempre necesita una digestión con ADNasa. Esto es necesario ya que la selectividad representada para el aislamiento de ARN solo no es suficiente con el procedimiento descrito. El ADN bicatenario debe eliminarse adicionalmente mediante un procedimiento enzimático.

El documento WO97/37040 A2 también remite a un procedimiento para la separación de ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios, especialmente en lo referente al aislamiento de ARN de VHC de fluidos corporales. Como ya se ha dado a conocer en la memoria de patente EP1 146 049 B1, en el documento WO 97/37040 A2 también se realiza la unión del ácido nucleico bicatenario a un material de sílice de manera que el tampón utilizado para esto necesita una alta concentración de EDTA (al menos 100 mM). Para esto se necesita la presencia de un formador de complejos en alta concentración para unir ácido nucleico bicatenario a partículas de sílice mineral y evitar la unión de ácido

nucleico monocatenario.

En la patente de EE.UU. 5.155.018 se describe un procedimiento y un kit de prueba para el aislamiento de ARN y la purificación de fuentes biológicas. En ella se describe en el ejemplo 2 el aislamiento de ARN usando como disolución una mezcla de tiocianato de guanidina 5 M, ácido acético al 0,25% y 2-mercaptoetanol al 1%.

El objetivo de la presente invención se basó en suprimir las desventajas de los procedimientos conocidos y poner a disposición un mejor procedimiento para la separación de ácidos nucleicos mono y bicatenarios.

El objetivo se alcanzó según las características de la reivindicación 1. Las reivindicaciones 2 a 9 representan formas de realización preferidas de la invención.

El procedimiento según la invención para el aislamiento en paralelo de ácidos nucleicos bi y monocatenarios, así como para la eliminación selectiva de ácidos nucleicos bicatenarios, de una mezcla de ácidos nucleicos bi y monocatenarios o de fuentes que contienen estas sustancias se caracteriza por las siguientes etapas:

a) la muestra lisada u homogeneizada se ajusta en ausencia de alcohol o sustancias complejantes de iones alcalinotérreos, o detergentes, dispersantes o humectantes con una disolución salina acuosa a una concentración superior a 1 M de forma que el ácido nucleico bicatenario se adsorbe a un soporte sólido, mientras que el ácido nucleico monocatenario no se adsorbe y queda en la disolución b) se elimina el soporte con el ácido nucleico adsorbido c) la disolución con el ácido nucleico monocatenario se mezcla con una disolución alcohólica con una concentración del 1 al 90% en volumen y se pone en

contacto con otro soporte sólido, adsorbiéndose el

ácido...

1. Procedimiento para el aislamiento en paralelo de ácidos nucleicos bi y monocatenarios, así como para la eliminación selectiva de ácidos nucleicos bicatenarios de una mezcla de ácidos nucleicos bi y monocatenarios o de fuentes que contienen estas sustancias, caracterizado por las siguientes etapas:

a) la muestra lisada u homogeneizada se ajusta en ausencia de alcohol o sustancias complejantes de iones alcalinotérreos o detergentes, dispersantes o humectantes con una disolución salina acuosa con una concentración superior a 1 M de forma que el ácido nucleico bicatenario se adsorbe a un soporte sólido, mientras que el ácido nucleico monocatenario no se adsorbe y queda en la disolución b) eliminación del soporte con el ácido nucleico adsorbido c) la disolución con el ácido nucleico monocatenario se mezcla con una disolución alcohólica con una concentración del 1 al 90% en volumen y se pone en contacto con otro soporte sólido, adsorbiéndose el ácido nucleico monocatenario a este otro soporte.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico adsorbido al soporte sólido respectivo se lava y se eluye según procedimientos conocidos.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución salina acuosa está constituida por sales caotrópicas o no caotrópicas, preferiblemente por sales de guanidinio.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a

3, caracterizado porque como soporte sólido se usa un soporte mineral.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el soporte sólido es constituyente de una minicolumna de centrifugación.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque para la adsorción de ácidos nucleicos bicatenarios se usa el mismo material de soporte que para la adsorción de ácidos nucleicos monocatenarios.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la disolución alcohólica contiene alcoholes con 1 a 5 átomos de carbono.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la disolución alcohólica contiene adicionalmente otras sustancias como

a) tampón de acetato de sodio o de potasio o b) una mezcla de alcohol-detergente, especialmente detergentes no iónicos.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque para la absorción del ácido nucleico monocatenario se utiliza como soporte sólido un soporte mineral o partículas magnéticas de óxido de hierro, preferiblemente con superficies modificadas.