Péptidos receptores ciclados dobles mutantes que inhiben anticuerpos de Beta 1-adrenoceptor.

Un péptido cíclico de fórmula I:

ciclo(x-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-x) (I),

en la que

a) x es un aminoácido distinto de Cys;

b) n es cualquier número entero desde 1 hasta 15;

c) i es cualquier número entero desde 0 hasta 14;

d) xc es Pro;

e) y es un aminoácido distinto de Cys; y

en el que dicho péptido cíclico consta de al menos 16 y de como máximo 25 aminoácidos y comprende el tramo deaminoácidosAsp-Xxx1-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO: 45); o

Glu-Ser-Asp-Xxx1-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO: 46),

en el que Xxx1, Xxx3 y Xxx4 son un aminoácido distinto de Cys y en el que dicho péptido cíclico

i) es capaz de reducir una activación mediada por anticuerpos de receptor ß1-adrenérgico (ß1-AR);

ii) es capaz de unir (auto)anticuerpos frente al segundo bucle extracelular (ECII) de ß1-AR; y/o

iii) es capaz de inhibir la interacción entre ß1-AR y (auto)anticuerpos contra ECII de ß1-AR.

Péptidos receptores ciclados dobles mutantes que inhiben anticuerpos de β1-adrenoceptor.

La presente invención se refiere a mutantes de ciclopéptidos homólogos de β-AR que comprenden solamente dos residuos de cisteína capaces de formar un enlace intramolecular. También se divulgan en el presente documento péptidos lineales que pueden formar estos mutantes de ciclopéptidos y moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichos ciclopéptidos y péptidos lineales. Además, se divulgan los vectores y las células huésped recombinantes que comprenden dicha molécula de ácido nucleico. Se proporciona un procedimiento para producir los mutantes de ciclopéptidos divulgados. Está adicionalmente proporcionada una composición que comprende los péptidos de la invención. La presente invención también se refiere a medios terapéuticos y de diagnóstico, a procedimientos y usos que toman ventaja de los péptidos de la invención y a medios, procedimientos y usos para detectar anticuerpos antireceptores β-adrenérgicos como anticuerpos anti-receptores anti-β1 adrenérgicos.

La dilatación cardiaca y la insuficiencia de bombeo progresivas de etiología desconocida se han llamado miocardiopatía dilatada "idiopática" (DCM) (Richardson 1996 Circulation, 93, 841-842) . DCM representa una de las principales causas de insuficiencia cardiaca grave con una incidencia anual de hasta 100 pacientes y una prevalencia de 30-400 pacientes por millón (AHA report 2007) . Las mutaciones en los genes que codifican proteínas estructurales miocíticas (Morita 2005) y varias cardiotoxinas, incluyendo alcohol, antraciclinas y más recientemente, los anticuerpos monoclonales usados terapéuticamente (por ejemplo, trastuzumab) dan cuenta de aproximadamente un tercio de casos de DCM (Chien 2000, Fabrizio y Regan 1994) . La etiología de los dos tercios que quedan se entiende aún pobremente, sin embargo. Actualmente se piensa que la gran mayoría de DCM surgen a partir de una infección inicial (mayoritariamente vírica) que conduce a miocarditis aguda que tras activación del sistema inmune puede progresar a miocarditis autoinmune (crónica) que da como resultado dilatación cardiaca y fallo cardiaco congestivo grave; la última progresión ocurre particularmente, cuando están asociados (a) con el desarrollo de autoanticuerpos contra distintas proteínas de sarcolema miocíticas o de membrana que son esenciales para la función cardiaca (Freedman 2004, Jahns 2006) , o (b) con inflamación crónica del miocardio y persistencia vírica (Kuhl 2005) . Estos hallazgos recientes se refuerzan adicionalmente por el hecho, de que pacientes con DCM tienen a menudo alteraciones tanto en inmunidad celular como en inmunidad humoral (Jahns 2006, Limas 1997, Luppi 1998, Mahrholdt 2006) . En tales condiciones una reacción inflamatoria aguda puede pasar a una clase de inflamación de bajo grado (MacLellan 2003) facilitando el desarrollo de respuestas inmunes anormales o erróneas a la activación infecciosa primordial (Freedman 2004, Kuhl 2005, MacLellan y Lusis 2003, Maekawa 2007, Smulski 2006) .

En el contexto de su respuesta humoral se ha encontrado que un número sustancial de pacientes de DCM desarrollan anticuerpos de reacción cruzada y/o autoanticuerpos frente a diferentes antígenos cardiacos, incluyendo proteínas mitocondriales (por ejemplo, translocador de nucleótidos de adenina, lipoamida y piruvato deshidrogenasa (Pohlner 1997, Schultheiss 1985, Schultheiss 1988, Schulze 1999) ) , proteínas de sarcolema (por ejemplo, actina, laminina, miosina, troponina (Caforio 2002, Goser 2006, Li 2006, Neumann 1990, Okazaki 2003) ) y proteínas de membrana (por ejemplo, receptores adrenérgicos o muscarinérgicos de superficie celular (Christ. 2006, Fu 1993, Jahns 1999b, Magnusson 1994) . A partir de estos, sólo unos pocos anticuerpos seleccionados parecen ser capaces de causar daño tisular miocárdico y de inducir fallo cardiaco congestivo grave por sí mismos, sin embargo. Además, la predisposición genética individual (incluyendo el fenotipo de antígeno de leucocitos humano respectivo (HLA) y el fenotipo de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Limas 1996) ) también puede contribuir notablemente a la susceptibilidad a reacciones inmunitarias dirigidas a uno mismo y a la expresión fenotípica de la enfermedad (Limas 2004, MacLellan 2003) .

Homologías entre moléculas de superficie de miocitos tales como receptores de membrana y proteínas bacterianas

o víricas se han propuesto como un mecanismo para la elaboración de autoanticuerpos cardiacos endógenos por mimetismo de antígenos (Hoebeke 1996, Mobini 2004) . La enfermedad del corazón de Chagas, una miocardiopatía inflamatoria que evoluciona lentamente, es uno de los ejemplos más prominentes para este mecanismo (Elies 1996, Smulski 2006) . La enfermedad se origina a partir de una infección con el protozoo Tr y panosoma cruzi, el mimetismo molecular entre la proteína ribosómica P2β de T. cruzi y la mitad N-terminal del segundo bucle extracelular del receptor β1-adrenérgico (β1-AR) da como resultado la generación de anticuerpos reactivos de forma cruzada en aproximadamente el 30 % de los pacientes de la enfermedad de Chagas (Ferrari 1995) . Debido a que autoanticuerpos del receptor de pacientes con DCM reconocen preferentemente la mitad C-terminal del mismo bucle (Wallukat 1995) , se especulaba que estos anticuerpos podrían originarse a partir de mimetismo molecular entre el β1-AR y un patógeno vírico hasta ahora no identificado (Magnusson 1996) . Otro mecanismo -probablemente más relevante-que conduce a la producción de autoanticuerpos cardiacos endógenos sería daño cardiaco primario seguido por liberación (repentina o crónica) de una "cantidad crónica" de determinantes antigénicos a partir de la membrana miocítica o del citoplasma miocítico, previamente oculta al sistema inmune. Tal daño aparece más probablemente tras una infección aguda (miocarditis) , enfermedad cardiaca tóxica, o enfermedad cardiaca isquémica (infarto de miocardio) que da como resultado apoptosis o necrosis (Caforio 2002, Rose 2001) . La presentación de antígenos propios miocárdicos al sistema inmune puede inducir después una respuesta autoinmune, que en el peor caso da como resultado la perpetuación de daños miocíticos mediados por el sistema inmune implicados bien en respuestas inmunes celulares (por ejemplo, de células T) , o bien en respuestas inmunes humorales (por ejemplo, de células B) , o bien en coactivación de tanto el sistema inmune innato como el sistema

inmune adaptativo (Eriksson 2003, Rose 2001) . Desde un punto de vista patofisiológico, parece razonable vincular el potencial dañino (por ejemplo, inductor de miocardiopatía) de un autoanticuerpo específico de corazón a la accesibilidad y a la importancia funcional del objetivo correspondiente. Los receptores de superficie miocítica son fácilmente accesibles a anticuerpos (Okazaki 2005) . Los dos candidatos más prometedores son el β1-AR (que representa el subtipo de adrenoceptor predominante en el corazón) y el receptor de acetilcolina M2-muscarínico, se han detectado autoanticuerpos contra ambos receptores en pacientes de DCM (Fu. 1993, Jahns 1999b, Matsui 1995) . Mientras que los anticuerpos anti-muscarínicos (que presentan una acción similar a agonista sobre el receptor de acetilcolina cardiaco M2) se han asociado principalmente con efectos cronotrópicos negativos en el nivel sinuatrial (por ejemplo, disfunción del nódulo sinusal, fibrilación atrial (Baba 2004, Wang. 1996) ) , se han asociado anticuerpos anti-β1-AR tanto con la aparición de arritmias graves a nivel ventricular (Christ 2001, Iwata 2001a) , como con el desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda (maladaptiva) , que cambia finalmente a agrandamiento ventricular externo y a fallo cardiaco progresivo (Iwata 2001b, Jahns 1999b, Khoynezhad 2007) . Parece que ambos anticuerpos están dirigidos contra el segundo bucle extracelular de los respectivos receptores. Para generar una respuesta autoinmunitaria, las proteínas de membrana miocíticas (por ejemplo, receptores) deben degradarse a oligopéptidos normales capaces de formar un complejo con una molécula de MHC o HLA de clase II del huésped (Hoebeke 1996) . En caso del adrenorreceptor β1-AR humano el análisis basado en ordenadores para extensiones aminoacídicas inmunogénicas potenciales ha mostrado, que la única parte de la molécula receptora que contiene epítopos de células B y T y que está accesible a anticuerpos era de hecho el segundo bucle de receptor extracelular predecido (β1-ECII) (Hoebeke 1996) . Esto podría explicar el uso exitoso de péptidos de segundo... [Seguir leyendo]

1. Un péptido cíclico de fórmula I:

ciclo (x-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-x) (I) ,

en la que

a) x es un aminoácido distinto de Cys;

b) n es cualquier número entero desde 1 hasta 15;

c) i es cualquier número entero desde 0 hasta 14;

d) xc es Pro;

e) y es un aminoácido distinto de Cys; y

en el que dicho péptido cíclico consta de al menos 16 y de como máximo 25 aminoácidos y comprende el tramo de

aminoácidos Asp-Xxx1-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO: 45) ; o Glu-Ser-Asp-Xxx1-Xxx4-Arg-Arg-Cys-Xxx3-Asn-Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO: 46) ,

en el que Xxx1, Xxx3 y Xxx4 son un aminoácido distinto de Cys y en el que dicho péptido cíclico

i) es capaz de reducir una activación mediada por anticuerpos de receptor β1-adrenérgico (β1-AR) ;

ii) es capaz de unir (auto) anticuerpos frente al segundo bucle extracelular (ECII) de β1-AR; y/o

iii) es capaz de inhibir la interacción entre β1-AR y (auto) anticuerpos contra ECII de β1-AR.

2. El péptido cíclico de la reivindicación 1, en el que y se selecciona individual e independientemente del grupo constituido por aminoácidos polares.

3. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que y es Ser o un análogo de Ser.

4. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que h es 5, 8 o 9 y/o en el que i es 3, 4 o 6.

5. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un péptido cíclico de fórmula I' o I": ciclo (xI-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-x) (I') ;

ciclo (xIII-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-x) (I") , en el que xI es Ala, Gly, Val, Thr o Ser y xIII es Arg.

6. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un péptido cíclico de fórmula I'" o I"": ciclo (x1-xh-cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xII) (I'") ;

ciclo (xIII-xh-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xIV) (I"") , en el que XII es GIn, Glu, Asp o Asn y xIV es Gly o un análogo de Gly.

7. El péptido cíclico de la reivindicación 5 o 6, en el que x1 es Ala.

8. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que xII es GIn o Glu.

9. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que y no es Pro y/o x salvo xc no es Pro.

10. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que es un péptido cíclico de fórmula II, III o III':

ciclo (x1-x-x1-x-x-x-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xII) (II) ; ciclo (x1-x2-x-xi-x-x-x1-x-x-x-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xII) (lll) ; ciclo (xIII-x-x1-x-x-x1-x-x-x-Cys-x-x-x-xc-x-Cys-y-xi-xIV) (III') ,

en las que

a) x1 o Xxx1 está seleccionado individualmente e independientemente del grupo constituido por aminoácidos ácidos; y/o

b) x2 está seleccionado individualmente e independientemente del grupo constituido por aminoácidos básicos.

11. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que es un péptido cíclico de fórmula IV, V

o V': ciclo (x1-x-x1-x4-x-x-Cys-x3-x-x-xc-x-Cys-y-x1-x3-x3-xII) (IV) ;

ciclo (x1-x2-x4-x1-x4-x-x1-x4-x-x-Cys-x3-x-x-xc-x-Cys-y-x1-x3-x3-x4-x5-x2-xII) (V) ;

ciclo (xIII-x4-x1-x4-x-x1-x4-x-x-Cys-x3-x-x-xc-x-Cys-y-x1-x3-x3-x4-xIV) (V’) , en las que a) x1 o Xxx1 están seleccionados individualmente e independientemente del grupo constituido por

aminoácidos ácidos;

b) x2 está seleccionado individualmente e independientemente del grupo constituido por aminoácidos básicos; c) x3 o Xxx3 está individualmente e independientemente seleccionado del grupo constituido por Leu,

He, Val, Met, Trp, Tyr y Phe; y/o d) x4 o Xxx4 está individualmente e independientemente seleccionado del grupo constituido por Ser, Thr, Ala y Gly.

12. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende el tramo aminoacídico

Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys; o Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys.

13. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que es un péptido cíclico seleccionado a partir del grupo constituido por:

a) un péptido cíclico formable o formado por la secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de las SEQ ID NO: 41, 43, 1 a 4 y 17 a 20;

b) un péptido cíclico formable o formado por una secuencia de aminoácidos como se codifica por una secuencia de nucleótidos como se describe en una cualquiera de SEQ ID NO: 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 y 54;

c) un péptido cíclico formable o formado por una secuencia de aminoácidos según se codifican por una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos según se describe en una cualquiera de SEQ ID NO: 42, 44, 9 a 12, 25 a 28, 49, 50, 53 y 54 debido a la degeneración del código genético; y

d) un péptido cíclico de una cualquiera de fórmula VI a IX':

14. El péptido cíclico de la reivindicación 13, en el que al menos uno de los aminoácidos ácidos está 5 reemplazado por un aminoácido diferente seleccionado del grupo constituido por aminoácidos ácidos.

15. El péptido cíclico de la reivindicación 13 o 14, en el que al menos uno de los aminoácidos básicos está reemplazado por un aminoácido diferente seleccionado del grupo constituido por aminoácidos básicos.

16. El péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que al menos uno de los residuos

aminoacídicos alifáticos está reemplazado por un aminoácido diferente seleccionado del grupo constituido por 10 aminoácidos alifáticos.

17. Un procedimiento para producir un péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende las etapas de

a) (i) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico de la molécula que codifica el armazón aminoacídico del péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o un vector que 15 comprende dicha molécula de ácido nucleico en condiciones tales que el armazón aminoacídico del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 se expresa y recuperar dicho armazón aminoacídico; o

(ii) sintetizar químicamente el armazón aminoacídico del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; y

b) ciclación de dicho armazón de aminoácidos para formar el péptido cíclico de una cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 16.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 9 a 12, 25 a 28, 42 y 44 o una secuencia de nucleótidos que difiere de las mismas debido a la degeneración del código genético.

19. Una composición que comprende un péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y 25 opcionalmente un vehículo.

20. La composición de la reivindicación 19, en la que dicha composición es una composición farmacéutica y dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Un péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una composición farmacéutica de la reivindicación 20 y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usar en

a) el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad donde la actividad de un β-AR está potenciada;

b) el tratamiento de un paciente que tiene anticuerpos frente a un β-AR; o

c) inducir inmunotolerancia.

22. El péptido cíclico o la composición farmacéutica de la reivindicación 21, en la que dicha enfermedad donde

la actividad de un receptor β-adrenérgico está potenciada es una enfermedad del corazón o en la que dicho paciente 5 sufre de una enfermedad del corazón.

23. El péptido cíclico o la composición farmacéutica de la reivindicación 22, en la que dicha enfermedad del corazón está seleccionada del grupo constituido por enfermedad cardiaca infecciosa y no infecciosa, enfermedad cardiaca isquémica y no isquémica, enfermedad cardiaca inflamatoria y miocarditis, dilatación cardiaca, miocardiopatía idiopática, miocardiopatía dilatada (DCM) (idiopática) , miocardiopatía inmune, fallo cardiaco y

cualquier arritmia cardiaca incluyendo latidos de captura prematuros ventriculares o supraventriculares así como arritmia auricular incluyendo fibrilación auricular y/o aleteo auricular.

24. El péptido cíclico o la composición farmacéutica de la reivindicación 22 o 23, en el que dicha enfermedad cardiaca es DCM (idiopática) .

25. El péptido cíclico o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el 15 que dicha enfermedad está inducida por anticuerpos frente a un β-AR.

26. El péptido cíclico o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el que dicho péptido cíclico o dicha composición farmacéutica se administra de tal manera que al menos se alcanzaron 0, 05 mg de dicho péptido cíclico por kg de peso corporal.

27. Procedimiento para detectar anticuerpos frente a un β-AR (en una muestra) que comprenden la etapa de

poner en contacto el péptido cíclico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 con dichos anticuerpos a detectarse.

28. El péptido cíclico, la composición farmacéutica o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que dicho β-AR es β1-AR.