Sonda para su utilización en el diagnóstico de porfiria y para la cuantificación alélica de genes relativos a la porfiria mediante reacciones de ligación y amplificación.

Asociación de sondas que comprende un grupo de sondas que tienen en un terminal de la secuencia un tag y en el otro terminal una secuencia que se hibridiza a por lo menos una parte de la secuencia del gen FECH,

dichas secuencias hibridizantes siendo SEQ ID NOs 1-24 y un grupo de sondas que tienen en un terminal de la secuencia un tag y en el otro terminal una secuencia que se hibridiza a por lo menos una parte de la secuencia del gen FECH, dichas secuencias hibridizantes siendo SEQ ID NOs 142-165.

Sonda para su utilizacion en el diagnostico de porfiria y para la cuantificacion alelica de genes relativos a la porfiria mediante reacciones de ligacion y amplificacion La presente invencion se refiere a sondas y a la utilizacion de dichas sondas en un metodo de diagnostico y a un kit 5 de diagnostico para detectar la presencia de Porfiria, en particular para detectar la cantidad alelica de genes relativos a la Porfiria.

El termino Porfiria incluye un grupo de siete enfermedades debidas a anomalias geneticas, a menudo relacionadas con un fenotipo clinico grave, que se derivan de defectos hereditarios que implican al menos una de las enzimas de la via biosintetica del hemo, un elemento reactivo de hemoproteinas celulares tales como, por ejemplo,

hemoglobina, citocromos, peroxidase, etc. Las secuencias de los siete genes responsables de la Porfiria en el homo sapiens estan disponibles en el banco de datos NCBI con los siguientes numeros de identificacion (GeneID) :

- aminolevulinato delta dehidratasa (ALAD) - 210;

- hidroximetilbilano sintasa (HMBS) - 3145;

- uroporfirinogeno sintasa (UROS) - 7390;

- uroporfirinogeno decarboxilasa (UROD) - 7389;

- coproporfirinoogeno oxidasa (CPOX) - 1371;

- protoporfirinogeno oxidasa (PPOX) - 5498; y

- ferroquelatasa (FECH) - 2235.

Se sabe que dichos siete genes son responsables en el Homo sapiens de siete formas diferentes de Porfiria, que, en 20 funcion de los sintomas clinicos, pueden ser clasificadas como agudas o cronicas.

La Porfiria aguda se manifiesta a traves de varios sintomas que ocurren de manera aguda esporadicamente, inducidos por factores exogenos tales como infecciones intercurrentes, dietas de bajas calorias, ingestion de productos alcoholicos y farmacos con accion porfirinogenica (barbituricos, sulfonamidas, anestesicos y anticonceptivos por via oral) , o por factores endogenos tales como, por ejemplo, estres fisico o quimico y

fluctuaciones de hormonas esteroideas gonadales (estrogenas y progesteronas) durante los periodos premestruales y de embarazo. Los ataques tienen inicio principalmente con sintomas neurologicos que pueden manifestarse tanto en el sistema nervioso central como en el vegetativo-periferico.

La Porfiria cronica, por el contrario, esta caracterizada por fotosensibilidad cutanea relacionada con la acumulacion de precursores fotorreactivos principalmente en la epidermis, donde vienen excitados con facilidad por la luz dando lugar a radicales libres de oxigeno con consiguiente dano del tejido y una fuerte respuesta inflamatoria. Generalmente la fotosensibilidad esta restringida a las superficies expuestas directamente a la luz solar (dorso de las manos, cuello, piernas y tobillos en las mujeres) , especialmente si son sometidas a repetidos traumatismos o si estan caracterizadas por una aumentada fragilidad de la piel. Sin embargo, a menudo los signos externos de dano cutaneo pueden no existir o pueden limitarse principalmente a edemas, eritemas y/o urticarias.

La tabla que sigue muestra la relacion entre gen, tipo de Porfiria y sintomas clinicos:

Gen defectuoso Porfiria Sintomas clinicos

HMBS Porfiria aguda intermitente (PAI) Porfiria aguda

PPOX Porfiria diversificada (PV) Porfiria aguda

CPOX Coproporfiria hereditaria (CPH) Porfiria aguda

ALAD Porfiria de deficiencia ALAD (PDA) Porfiria aguda

UROD Porfiria cutanea tardia (PCT) Porfiria cronica

FECH Protoporfiria eritropoietica (PPE) Porfiria cronica

UROS Porfiria eritropoietica congenita (PEC) Porfiria cronica

Asimismo, se sabe que mutaciones especiales de los siete genes antes mencionados pueden implicar genes adyacentes o regiones intergenicas flanqueantes. Por lo tanto, han sido seleccionadas las correspondientes siete regiones cromosomicas incluyendo el gen implicado y los genes flanqueantes. En un primer momento, dichas regiones han sido seleccionadas de modo que las mismas incluyeran al menos un gen antes y un gen despues del gen implicado, para luego extenderlas en base a la densidad genica del locus. En el ambito de la presente invencion, dichas regiones cromosomicas, listadas abajo, vienen incorporadas en la definicion del mismo gen:

gen ALAD: NC 000009:115174000-115213000 (complemento inverso)

gen HMBS: NC 000011:118442000-118494000

gen UROS: NC 000010:127443000-127533000 (complemento inverso)

gen UROD: NC 000001:45225000-45320000

gen CPOX: NC 000003: 99733000-99863000 (complemento inverso)

gen PPOX: NC 000001:159334500-159451000

gen FECH: NC 000018:53290000-53442000 (complemento inverso) .

La preponderancia de Porfiria no puede ser establecida de manera definitiva; sobre todo porque a menudo falta el diagnostico. En general, se cree que esas enfermedades tienen baja frecuencia, con preponderancia de las distintas formas variables de una raza a otra y tambien de una zona geografica a otra. En Europa hay aproximadamente 75.000 pacientes que padecen Porfiria aguda, pero es posible encontrar una gran preponderancia en algunas zonas geograficas. Dos ejemplos son Escocia, donde un paciente cada 50.000 padece de una forma de Porfiria, con preponderancia de PAI (Porfiria aguda intermitente, en ingles Intermittent Acute Porphyria IAP) y PCT (Porfiria cutanea tardia, en ingles Porphyria Cutanea Tarda) , y Sudafrica, donde la forma preponderante es la PV (Porfiria Variegada, en ingles Variegate Porphyria) , con una incidencia de uno cada 1.000 personas entre la poblacion blanca.

En nuestros dias, el diagnostico de la Porfiria no es sencillo debido a la analogia del cuadro clinico con otras enfermedades de origen diferente. Asimismo, las enfermedades relacionadas con la Porfiria son clasificadas como raras y la falta de instrumentos de diagnostico faciles de usar a menudo es motivo de errores de diagnostico.

En efecto, actualmente el diagnostico se basa principalmente en la identificacion de una elevada concentracion de productos intermedios de la via biosintetica (porfirinas libres) en eritrocitos, plasma, orinas y heces, que no es siempre posible en todas las estructuras clinicas y que no es totalmente fiable debido a las fluctuaciones fisiologicas que sufren esos metabolitos.

Por otro lado, la determinacion de la actividad enzimatica eritrocitaria de las enzimas individuales puede ser llevada a cabo unicamente con algunas de ellas. Donde fuera posible, tal determinacion no es totalmente fiable debido a la superposicion entre el intervalo de valores normales y valores patologicos.

Actualmente la identificacion de anomalias geneticas fundamento de las diferentes formas de Porfiria utiliza un protocolo de diagnostico, compuesto por una reaccion en cadena de la polimerasa (RCP) (en ingles, PCR = Polymerase Chain Reaction) y una secuenciacion automatica, que principalmente describe mutaciones puntiformes o pequenas supresiones -inserciones en las regiones codificantes y en las zonas de union de los genes implicados. Esos tipos de defectos geneticos confirman el diagnostico solo en el 80% de los pacientes con sintomas clinicos y

bioquimicos que pueden ser relacionados con la Porfiria. El restante 20%, que por lo tanto no viene diagnosticado, recientes evidencias sugieren, como causa de la Porfiria, la presencia de reorganizaciones cromosomicas (supresiones y duplicaciones) . Dichos defectos no pueden ser identificados con el protocolo estandar de analisis.

Actualmente, la identificacion de esas mutaciones particulares viene llevada a cabo a traves de dos aproximaciones, las cuales son caras y demandan mucho tiempo.

La primera aproximacion es el estudio sobre la "segregacion familiar de polimorfismos conocidos". Dicha aproximacion requiere, obligatoriamente, los padres biologicos del paciente y, en caso de defecto de identificacion, la presencia de polimorfismos con una frecuencia significativa en la poblacion. Ademas, dicha aproximacion no es bastante decisiva puesto que la presencia de dichos polimorfismos podria no ser suficiente para demostrar la carencia de segregacion mendeliana, que es absolutamente necesaria para el diagnostico de supresiones genicas.

De todos modos, con dicha aproximacion no es posible identificar las duplicaciones.

La segunda aproximacion es la denominada "dosis genica", un metodo de cuantificacion relativa de amplicones correspondientes al gen implicado. Dicha aproximacion utiliza varios pares de cebadores con un elevado riesgo de formacion de dimeros. Asimismo, la diferente eficacia de asociacion (annealing) de los distintos pares de cebadores perjudica la reaccion de amplificacion, puesto que las dianas mas cortas son favorecidas termodinamicamente y su 50 competicion reduce la fiabilidad del ensayo de cuantificacion relativa. Finalmente, no todas... [Seguir leyendo]

1. Asociacion de sondas que comprende un grupo de sondas que tienen en un terminal de la secuencia un tag y en el otro terminal una secuencia que se hibridiza a por lo menos una parte de la secuencia del gen FECH, dichas secuencias hibridizantes siendo SEQ ID NOs 1-24 y un grupo de sondas que tienen en un terminal de la secuencia un tag y en el otro terminal una secuencia que se hibridiza a por lo menos una parte de la secuencia del gen FECH, dichas secuencias hibridizantes siendo SEQ ID NO.

14. 165.

2. Asociacion de sondas segun la reivindicacion 1, donde el tag es SEQ ID NO 283 o SEQ ID NO 284.

3. Asociacion de sondas segun la reivindicacion 1 o 2, donde el tag esta presente en el terminal 5' y la secuencia hibridizante en el terminal 3'.

4. Asociacion de sondas segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, donde el tag esta presente en el terminal 5' de SEQ ID NOs 1-24.

5. Asociacion segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, donde el tag en el terminal 5' de SEQ ID NOs 1-24 es la SEQ ID NO 283.

6. Asociacion de sondas segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, donde el tag esta presente en el terminal 3' y la secuencia hibridizante esta presente en el terminal 5'.

7. Asociacion de sondas segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, donde el tag esta presente en el terminal 3' de SEQ ID NO.

14. 165.

8. Asociacion de sondas segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, donde el tag en el terminal 3' de SEQ ID NO.

14. 165 es SEQ ID NO 284.

9. Metodo para determinar la presencia de Protoporfiria eritropoietica en una muestra de tejido biologico que incluye las siguientes etapas operativas:

(i) extraccion de acido nucleico de una muestra;

(ii) introduccion de la asociacion de sondas segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 dentro del acido nucleico extraido segun la etapa operativa (i) , y reaccion en presencia de al menos una enzima ligasa en al menos una reaccion de ligacion;

(iii) ejecucion de al menos una reaccion de amplificacion en las sondas obtenidas a partir de la etapa operativa (ii) , y

(iv) determinacion de la presencia y de la cantidad de secuencias nucleotidicas resultantes de la ligacion y la amplificacion.

10. Metodo segun la reivindicacion 8, donde un par de sondas para el control interno viene introducido en la etapa operativa (ii) , dicho par de sondas preferentemente teniendo secuencias hibridizantes: SEQ ID NO.

28. 286 y/.

28. 288 y/.

28. 290, y el mismo tag de la asociacion de sondas presente en la etapa operativa (ii) .

11. Metodo segun la reivindicacion 10, donde la informacion dada por el par de sondas que tienen secuencias hibridizantes SEQ ID NO.

28. 286 y/.

28. 288 y/.

28. 290 viene utilizada para normalizar los datos determinados de conformidad con la etapa operativa (iv) .

12. Uso de la asociacion de sondas segun una cualquiera de las precedentes reivindicaciones de 1 a 8 en una reaccion de ligacion y una reaccion RCP para diagnosticar la presencia de anomalias porfiricas.

13. Uso segun la reivindicacion 12 para diagnosticar anomalias del gen FECH.

14. Kit para diagnosticar Protoporfiria eritropoietica que incluye al menos un compartimiento que contiene en su interior los reactivos para efectuar por lo menos una ligacion y por lo menos una reaccion RCP, y por lo menos un compartimiento que contiene en su interior la asociacion de las sondas segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8.

1) ºiirriaacion sonda L sonda R

3'

5'

Tag F

Tag R

Secuencia Secuencia hibridizante hibridizante 3'

5'

3' 5' ADN diana 2) ºiiaacion

3) ºRCP F 3' F R R F ADN diana R F F R 5' R

4) ºSpparacionºporºpepctroforpsisºcapiear

FIG. 1

ionait (aºrpeati>aºapeºproa (ctoºa.peificaao ºpºprpsaaaºpn ºn (cepotiaos Cantidad de producto amplificado detectado ILKAP DACH DEFB129FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4