Una nanopartícula deshidratada que comprenda un ARNip y quitosano.

Nanopartículas deshidratadas de quitosano

ANTECEDENTES

Desde el descubrimiento del mecanismo de la interferencia por Acido Ribonucleico (iARN) , ARNs interferentes pequeños (ARNips) han demostrado ser valiosas herramientas para examinar la función genética y potencialmente terapéuticas. La iARN tiene lugar cuando el ARN de doble hebra (dh) citoplásmica guía un complejo silenciador inducido por ARN (CSIA) para adherir las secuencias homólogas en una molécula mensajera de ARN resultando en un silenciamiento génico. Los sistemas portadores son una exigencia para un suministro eficiente de ARNips por la superación de barreras extracelulares e intracelulares. Los sistemas no virales lípidos (lipoplexos) y basados en polímeros policatiónicos (poliplexos) son candidatos atractivos debido a las cuestiones de inmunogenicidad y seguridad asociados con un suministro viral.

En genómica y en validación de objetivos farmacológicos, la tendencia se dirige hacia una alta pérdida de rendimiento de exploración de función utilizando iARN. Se han desarrollado diferentes aproximaciones utilizando genotecas de secuencias suministradas como ARNips químicamente sintetizados o plásmidos de expresión de ARNip de tallo-bucle corto por vectores virales. El suministro no viral de ARNips ofrece un mayor control de la concentración de ARNip y muestras predecibles de toxicidad. En los sistemas de alto rendimiento de exploración usando ARNip, la estrategia común es mezclar ARNip con un agente de transfección lípido catiónico para formar lipoplexos, estos pueden ser entonces añadidos conjuntamente con gelatina con el objeto de facilitar el reconocimiento del reagente sobre platinas de microscopio para su análisis.

Desafortunadamente, el agente de transfección no viral, por sí mismo, con frecuencia altera la expresión génica; en consecuencia, cualquier procedimiento exhaustivo de exploración debería usar diversos vehículos de suministro para reducir este efecto sobre los resultados obtenidos. Una combinación de sistemas tradicionales y nuevos de formulaciones de ARNip reconocibles y almacenables ofrecería, por consiguiente, una certeza mejorada de los resultados obtenidos en exploraciones de ARNip de alto rendimiento.

El ARNip está siendo también desarrollado como una droga terapéutica para silenciar genes implicados en enfermedades. Con objeto de que las drogas basadas en nucleótidos atraigan un uso clínico universalmente extendido, se necesitan fórmulas con dosificación, actividad y efectos secundarios controlados. Las formulaciones acuosas de complejos no virales tienen un problema para cumplir con estas exigencias en cuanto se deterioran rápidamente por agregación si se almacenan a 25º C, 4º C ó -20º C.

En cuanto tanto las exploraciones de ARNip como la terapéutica con ARNip podría beneficiarse de formulaciones de ARNip almacenables, localmente activas, se necesita desarrollar dichos sistemas. Las nanopartículas de quitosano que comprenden ARNip se conocen de Biomaterials, 28, Febrero 2007, 1280-8.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una nanopartícula deshidratada que comprende un ARNip y quitosano. El ARNip es apto para modular la expresión de un gen objetivo. Tales nanopartículas son útiles en genómica y validación de objetivos farmacológicos. Además, son útiles como medicamentos.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Efecto de la sucrosa en el remanente pARNi/quitosano de eGFP en células H1299. Las muestras de ARNip/quitosano fueron añadidas en la presencia de concentraciones variables de sucrosa en los pocillos de 24 planchas de pocillos en las concentraciones indicadas de ARNip. Las planchas fueron entonces secadas con congelación, sembradas con línea celular H1299 y transfectadas durante 48 horas. La Fluorescencia fue medida por citometría de flujo y normalizada a un controlo no transfectado. Todas las muestras fueron tratadas por triplicado.

Figura 2. Remanente de eGFP en células H1299 con TKO/ ARNip Trans-IT y quitosano/ARNip.

Las muestras de quitosano/ARNip que contienen un 10 % de sucrosa y TKO/Mirus/ARNip fueron añadidas en las concentraciones indicadas en los pocillos de una plancha de 24 pocillos. Las planchas fueron entonces secadas con congelación, sembradas con línea celular H1299 y transfectadas durante 48 horas. La Fluorescencia fue medida por citometría de flujo y normalizada a un control no transfectado. Todas las muestras fueron tratadas por triplicado.

Figura 3. Efecto del almacenaje sobre la actividad de quitosano/ARNip y Mirus/ARNip. Las formulaciones de quitosano/ARNip (10% de sucrosa) secadas con congelación y plancheadas y de Trans-IT TKO/ARNip fueron lamacenadas a 25º C en una luz solar moderada. En diferentes momentos, las células H1299 fueron plancheadas y el remanente de eGFP fue medido. Los niveles de fluorescencia fueron normalizados a un control no transfectado.

Figura 4. Viabilidad de H1299 y células en bruto sujetas a quitosano/pARNi y Trans-IT TKO/pARNi. Las muestras de quitosano/ARNip fueron secadas por congelación en pocillos de planchas de 24 pocillos. Las planchas fueron sembradas con células H1299 (Figura 4A) o células en bruto (Figura 4B) y transfectadas durante 48 horas. Fueron añadidos entonces 20 μl de solución de citotoxicidad acuosa a los pocillos y, después de 90 minutos, la absorbencia estaba lista. Los valores de viabilidad fueron normalizados al control no transfectado. Todas las muestras por triplicado.

Figura 5. Revestimiento de estructuras de ingeniería de tejidos con quitosano/ARNip que contenga un 10 % de sucrosa. Las estructuras de Poli-ε-caprolactona fueron revestidas con partículas de quitosano/ARNip. Las estructuras sin (Figura 5A) y con (Figura 5B) revestimiento de partículas de quitosano/ARNip fueron visualizadas usando microscopía de escaneo por electrones. Ver el ejemplo 2 para más detalle.

Figura 6. A las estructuras revestidas se les añadió también agua y la presencia de partículas de quitosano fabricadas con ARNip fluorescente fue investigada usando microscopía de fluorescencia con – focal (Figura 6A) . Finalmente, fueron sembradas células madre mesenquimatosas de rata sobre las estructuras y su absorción de pARNi fue evaluada tras 24 horas usando microscopía de fluorescencia con – focal (Figura 6B) . Se muestran imágenes representativas. Ver ejemplo 2 para más detalle.

Figura 7. Absorción de quitosano/ARNip en diversas líneas celulares neurales. Se añadieron muestras de quitosano/ARNip conteniendo 10 % de sucrosa en los pocillos de planchas de 24 pocillos. Las planchas fueron entonces secadas por congelación, sembradas con células y transfectadas durante 24 horas. La absorción de ARNip fluorescente fue investigada usando microscopía fluorescente. Todas las muestras fueron tratadas por triplicado, se exhiben imágenes representativas.

Divulgación de la invención En un primer aspecto, la invención proporciona una nanopartícula deshidratada que comprende un ARNip y quitosano. La nanopartícula deshidratada es ventajosa, por ejemplo, porque prolonga el período de tiempo en el que la nanopartícula de ARNip mantiene su actividad. Además, en algunas realizaciones permite el almacenaje a temperatura ambiente. Como resultará claro de las realizaciones descritas infra, las nanopartículas son también favorables porque pueden ser inmovilizadas sobre soportes sólidos, que permiten nuevas aplicaciones de las nanopartículas.

El término quitosano, tal como se usa aquí, tiene el mismo significado como el que normalmente tiene en el estado de la técnica. El quitosano se refiere a un polisacárido linear compuesto de D-glucosamina (unidad deacetilada) º- (1-4) -enlazada y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) . El quitosano es generalmente producido por deacetilación de quitina, que es el elemento estructural en el exoesqueleto de crustáceos (cangrejos, camarón, etc.) . El grado de deacetilación en quitosano comercial está en el intervalo de entre 60-100 %. En una realización preferida, pueden ser usados también derivados de quitosano, por ejemplo, los obtenidos por modificación química del quitosano.

Preferiblemente, el contenido en agua de la partícula deshidratada es de menos de 5 % (peso por agua de agua/nanopartícula) . En otras realizaciones, el contenido en agua es de menos de 4 %, 3 %, 2 % y 1 % respectivamente. Es más preferido un contenido en agua de menos de 0, 1 %.

El ácido nucleico de la nanopartícula es una molécula... [Seguir leyendo]

1. Una nanopartícula deshidratada que comprenda un ARNip y quitosano.

2. La nanopartícula de la reivindicación 1 comprendiendo menos de 1% de agua por peso total.

3. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes siendo preparada por liofilización.

4. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes siendo incluida en una partícula de liberación controlada más grande, un depósito de droga implantable o una estructura biodegradable para ingeniería de tejidos.

5. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes siendo secada sobre una superficie.

6. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes siendo preparada por un procedimiento que comprenda:

a. Disponer de una solución de quitosano.

b. Disponer de una solución de ARNip.

c. Mezclar la solución de la fase a con la solución de la fase b.

d. Incubar la solución de la fase c bajo condiciones de formación compleja de tal manera que se formen nanopartículas de quitosano/ARNip.

7. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula de quitosano/ARNip no comprende un reticulador inicial.

8. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la solución de ARNip comprende ARNip en una concentración inferior a 100 μM.

9. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula con quitosano débilmente enlazado es para administración a través de la mucosa o para administración sistémica.

10. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la concentración de ARNip es mayor de 100 μM.

11. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la concentración de quitosano es de menos de 250 μg/ml.

12. La nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el tamaño de la partícula está entre 10 y 500 nm.

13. Una superficie que comprenda una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 112 en la que la nanopartícula haya sido secada sobre la superficie.

14. Un polvo de las nanopartículas de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

15. Una composición farmacéutica que comprenda la nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.