Método y kit para detectar la resistencia a herbicidas en plantas.

Método de prueba para determinar una resistencia a herbicidas específica en una planta viva específica,

comprendiendo dicho método:

- proporcionar un extracto de dicha planta viva específica, comprendiendo dicho extracto al menos un compuesto fitoquímico,

- detectar el al menos un compuesto fitoquímico observando visualmente dicho al menos un compuesto fitoquímico sobre un soporte sólido, o visualizarlos mediante luz visible y/o UV,

- correlacionar dicha visualización de dicho al menos un compuesto fitoquímico con una escala de visualización convencional de dicho al menos un compuesto fitoquímico de una planta resistente, que es del mismo biotipo que dicha planta viva específica, y

- evaluar de ese modo si dicha planta viva específica ha desarrollado resistencia hacia dicho herbicida específico.

Método y kit para detectar la resistencia a herbicidas en plantas Campo de la invención La presente invención se refiere a un método y a un kit para someter a prueba la presencia de resistencia en organismos vivos. Especialmente, la invención se refiere a un método y un kit para someter a prueba la presencia de resistencia en plantas en un momento temprano. Más específicamente, la invención se refiere a un método sencillo y rápido para detectar resistencia usando compuestos bioquímicos en organismos vivos que han desarrollado resistencia a herbicidas antes y/o después de la exposición a estrés químico tal como pesticidas (herbicidas) . El kit y el método se correlacionan con el tipo de compuestos bioquímicos, por ejemplo, compuestos fitoquímicos en plantas y/o el nivel de los compuestos bioquímicos en un organismo vivo expuesto a pesticidas con la presencia de compuestos bioquímicos relacionados con resistencia. El kit proporciona un método sencillo y rápido para detectar la existencia de resistencia, por ejemplo, para detectar la resistencia a herbicidas en plantas de malas hierbas o predice el tiempo en que una planta desarrolla resistencia, por ejemplo, el tiempo en que una planta de malas hierbas desarrolla resistencia a un herbicida. También es posible detectar plantas de cultivo que son tolerantes a herbicidas y que pueden estar presentes en campos cultivados con otra planta de cultivo.

Antecedentes de la invención Las plantas, los animales y otros organismos vivos incluyendo los hongos están expuestos a estrés de manera continua o temporal en la totalidad de su vida. Se sabe que diferentes tipos de estrés, diferentes tiempos de exposición y diferentes cantidades de un solo tipo de estrés pueden influir de diferente manera dependiendo de la especie de, por ejemplo, plantas o animales. Si el estrés se debe a compuestos químicos tales como pesticidas, algunos de los organismos individuales pueden desarrollar resistencia a este o estos pesticidas.

Cuando uno o unos cuantos individuos de una población desarrollan resistencia con respecto a un pesticida, estos individuos ven favorecido su crecimiento en entornos en los que los tratamientos con pesticidas se realizan frecuentemente. Con el tiempo, la población del organismo vivo se desarrollará para incluir más individuos que son resistentes a los tratamientos con pesticidas.

La resistencia en un organismo vivo, especialmente en un organismo que es dañino o perjudicial para, por ejemplo, plantas de cultivo y que reduce de ese modo el rendimiento de los cultivos puede tener consecuencias de gran alcance y, por tanto, es una ventaja que el desarrollo de resistencia pueda detectarse en una etapa temprana, siendo esto bastante antes de que un tratamiento con pesticidas haya perdido el efecto en una mayor parte de la población del organismo vivo.

La resistencia a un pesticida significa que el organismo ya no es sensible al pesticida o bien debido a una mutación que da como resultado un sitio diana insensible (también denominado “resistencia de sitio diana”) o bien el organismo se ha vuelto capaz de metabolizar el pesticida, lo que da como resultado un efecto reducido y de corta duración del pesticida (también denominado “resistencia metabólica”) . En este contexto, “resistencia de sitio diana” no se debe necesariamente sólo a una sola mutación dentro del organismo, sino que puede estar provocada por dos o más mutaciones en el genoma del organismo.

La resistencia a herbicidas a nivel mundial es un problema cada vez peor. Desde 1960 el número de casos únicos ha aumentado hasta más de 300.

En el plazo de los últimos 10 años particularmente, el número de casos de resistencia a inhibidores de ALS y ACCasa ha aumentado y de la manera más reciente, se ha notificado resistencia a glifosato.

El documento WO 03/031937 describe la identificación de marcadores polimórficos de la resistencia a herbicidas en plantas mediante el aislamiento de ADN genómico de una planta susceptible a herbicidas y una planta resistente a herbicidas de la misma especie y la realización de análisis genético con el ADN para identificar los marcadores polimórficos de la resistencia a herbicidas. Los marcadores polimórficos son para identificar malas hierbas resistentes a herbicidas y susceptibles a herbicidas.

El documento WO 01/86303 describe una detección de la polipéptido glutatión S-transferasa en una mala hierba. El polipéptido está relacionado con la resistencia de la mala hierba a herbicidas. El polipéptido se detecta mediante un antisuero que se une con el polipéptido. El antisuero unido puede visualizarse, por ejemplo, mediante ELISA.

En la presente invención, se usan las diferencias en la composición química de organismos vivos y especialmente de la composición fitoquímica de plantas de malas hierbas para desarrollar un nuevo método sencillo para detectar resistencia en plantas de malas hierbas y otros organismos vivos. El método y kit pueden usarse por agricultores o asesores para determinar si un control insatisfactorio de malas hierbas en un campo se debe al desarrollo de resistencia a herbicidas en la especie de mala hierba. El agricultor podrá ajustar el método de control de malas hierbas en relación con el resultado de prueba.

Se han usado compuestos fitoquímicos como biomarcadores para obtener un patrón de biomarcadores en plantas expuestas a estrés (documento WO 01/92879) . Un patrón de biomarcadores en plantas se define como los cambios en la composición y el contenido de compuestos fitoquímicos detectados en plantas después de la exposición a estrés tal como herbicidas.

Para poder impedir o retardar el desarrollo de resistencia en un organismo vivo es importante identificar la resistencia en una etapa temprana. Una detección temprana de la existencia de resistencia en, por ejemplo, malas hierbas, plagas y/u hongos patógenos es de especial interés para el sector agrario, principalmente para reducir el riesgo de usar pesticidas que ya no tienen ningún efecto. Una detección temprana de resistencia es también de interés en otros campos tales como en el control de insectos que viven en o cerca de seres humanos o que influyen en la salud de seres humanos, por ejemplo, con respecto a piojos, mosquitos y ratas.

La presente invención da a conocer un método sencillo, rápido y sumamente sensible para someter a prueba la existencia de resistencia en un organismo vivo hacia productos químicos tales como en plantas poco tiempo después de la exposición a productos químicos tales como pesticidas. El método se aprovecha de un cambio en la composición de compuestos químicos cuando se exponen organismos vivos a estrés, y estos compuestos pueden usarse como biomarcadores en el material procedente de un organismo vivo cuando se expone a estrés. Particularmente, la presente invención se refiere a un método de prueba para determinar la presencia de resistencia en plantas de malas hierbas expuestas a tratamiento químico con herbicidas.

Sumario de la invención En un aspecto principal, la invención se refiere a un método según la reivindicación 1.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para proporcionar una escala de visualización convencional para material procedente de una planta viva específica que se ha expuesto o no a un herbicida específico según la reivindicación 10.

En un aspecto, la invención se refiere a un kit de ensayo para someter a prueba la resistencia en una planta viva según la reivindicación 13.

Descripción de los dibujos Figura 1. El desarrollo de factores de resistencia en diferentes biotipos de la planta Stellaria media expuesta a tratamientos con herbicidas que incluyen los componentes activos yodosulfurón, tribenurón y florasulam.

Figura 2. En un experimento con Papaver rhoeas/Hussar OD, una mezcla de I1, A1 ADα1 (1:1:1) 4 gotas + 10 gotas de extracto de la planta (50 mg/ml extraídos con agua) + 15 gotas de ácido sulfúrico conc. presentan la fotografía a color de la figura 2. Los colores son (de izquierda a derecha) PANTONE® nº 535 (gris azulado) ; nº 452 (gris verdoso) ; nº 7544 (gris) , nº 415 (verde grisáceo) .

Figura 3. Cromatografía en capa fina (CCF) de extracto de Papaver rhoeas no expuesta y expuesta a Hussar. CCF 1) : placa: gel de sílice 60; disolvente: tolueno: acetato de etilo: dietilamina (70:20:10) . Más información en los ejemplos.

Figura 4. Cromatografía en capa fina (CCF) de extracto de Papaver rhoeas no expuesta y expuesta a Hussar. CCF 2) : placa: celulosa; disolvente: ácido acético al 15% en agua. Más información en los ejemplos.

Figura 5. Cromatografía en capa fina (CCF) de extracto de Papaver rhoeas... [Seguir leyendo]

1. Método de prueba para determinar una resistencia a herbicidas específica en una planta viva específica, comprendiendo dicho método:

-proporcionar un extracto de dicha planta viva específica, comprendiendo dicho extracto al menos un 5 compuesto fitoquímico,

-detectar el al menos un compuesto fitoquímico observando visualmente dicho al menos un compuesto fitoquímico sobre un soporte sólido, o visualizarlos mediante luz visible y/o UV,

-correlacionar dicha visualización de dicho al menos un compuesto fitoquímico con una escala de visualización convencional de dicho al menos un compuesto fitoquímico de una planta resistente, que es del

mismo biotipo que dicha planta viva específica, y

-evaluar de ese modo si dicha planta viva específica ha desarrollado resistencia hacia dicho herbicida específico.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el método antes de la etapa de proporcionar un extracto de dicha parte de una planta viva específica comprende además -exponer dicha al menos una planta viva específica a un herbicida específico,

-después de un periodo de tiempo, seleccionar al menos una parte de la planta viva específica que no está muerta debido a la exposición a dicho herbicida específico.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el método antes de visualizar el al menos un grupo de compuestos fitoquímicos comprende además,

-proporcionar al menos un reactivo químico aplicable para una reacción química con dicho al menos un grupo de compuestos fitoquímicos, y

-provocar una reacción química entre dichos reactivos químicos y compuestos fitoquímicos de dicho material vegetal vivo específico, y

en el que dicha visualización de al menos un grupo de compuestos fitoquímicos es una detección de un 25 resultado de dicha reacción química.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el reactivo químico se basa en uno o más de los compuestos rojo de clorofenol, rojo de metilo, rojo de etilo, azul de bromotimol, sal de sodio de 2, 6-diclorofenolindofenol, púrpura de bromocresol, ninhidrina, vainillina + hidróxido de potasio, glucosa, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, 2, 4-dinitrofenilhidrazina, cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, hidróxido de tetrabutilamonio, yodo + yoduro de potasio, nitrato de bismuto (III) , sulfato de amonio y hierro (III) , 2-metoxi-2, 4-difenil-3 (2H) furanona (MDPF) , difenilborinato de 2-aminoetilo, cloruro de hierro (III) , cloruro de aluminio, cloruro de berberina dihidratado, sal de sodio de 1, 2-naftoquinon-4-sulfona, antrona, 8-hidroxiquinolina, 2-aminodifenil (bifenil-2-amina) , orcinol, urea, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-aminobenzoico, ácido molibdatofosfórico, 2’, 7’diclorofluoresceína, sal de amonio del ácido 8-anilinonaftalin-1-sulfónico, rodamina, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdato de estaño (II) , cloruro de cobalto (II) , cloruro de paladio (II) , nitratoyoduro de potasio, vainillina, ácido sulfúrico, naftorresorcinol, azul de metileno, β-naftol, timol, fluoresceína, amoniaco, verde de bromocresol, azul de bromofenol, permanganato de potasio, 2, 7-diclorofluoresceína, rodamina 6G, éster 2-aminoetílico del ácido difenilbórico, ácido fosfórico, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdato de estaño (II) , cloruro de cobalto (II) , cloruro de paladio (II) , ninhidrina, 1-naftol, nitrato de bismuto (III) yoduro de potasio, ácido molibdatofosfórico, rodamina B, anisaldehído, nitrato de plata, cloruro de hierro (III) , cloruro de zinc y productos químicos o mezclas de los mismos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la evaluación del método se selecciona del grupo de evaluación cualitativa y/o cuantitativa y/o semicuantitativa o una combinación de las mismas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el uso de reactivos químicos y soporte sólido comprende las siguientes etapas:

-poner en contacto un extracto de dicha planta viva específica con al menos un reactivo químico,

-proporcionar una reacción química entre el extracto de material procedente de la planta viva y el al menos un reactivo químico,

-poner en contacto un soporte sólido con el material procedente de la planta viva específica que se hace reaccionar químicamente con el al menos un reactivo químico, de ese modo

- obtener un soporte sólido con un color (detección visual o con luz UV) -comparar el color y la intensidad de color con una escala de visualización convencional, -evaluar existencia de resistencia en dicha planta viva específica.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las pruebas se realizan separando compuestos individuales que pertenecen a dicho al menos un grupo de compuestos fitoquímicos obtenidos a partir de la planta viva.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las pruebas se realizan con al menos un grupo no separado de compuestos fitoquímicos obtenidos a partir de la planta viva específica.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección se realiza mediante

un método analítico seleccionado del grupo que consiste en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) , cromatografía de gases (GC) o espectrometría de masas (MS) o una combinación de dichos métodos analíticos.

10. Método para proporcionar una escala de visualización convencional para material procedente de una planta viva específica que se ha expuesto o no se ha expuesto a un herbicida específico, comprendiendo dicho 15 método las etapas de:

-someter al menos una planta viva específica a tipos conocidos y cantidades conocidas de un herbicida específico o no someterla a herbicida,

-obtener material procedente de dicha planta viva,

-determinar las respuestas fitoquímicas de dicho material procedente de dicha planta viva específica para 20 cada tipo de herbicida específico y/o para cada cantidad de herbicida, y

-obtener al menos un resultado convencional relacionado con dicho tipo de herbicida específico y/o con dicha cantidad de herbicida específico.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicha respuesta fitoquímica se basa en compuestos fitoquímicos en la planta viva que se correlacionan con la aparición de resistencia en dicha planta viva.

12. Método según cualquiera de la reivindicación 10 a 11, que incluye además las características de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Kit de ensayo para someter a prueba la resistencia a herbicidas en una planta viva, comprendiendo dicho kit de ensayo: -al menos un papel de filtro.

30. al menos un disolvente,

- al menos un medio de compresión, -al menos una escala de visualización convencional de al menos un compuesto fitoquímico de una planta viva específica, que se ha expuesto a un herbicida específico y/o cantidades conocidas de dicho herbicida específico, para determinar si una planta ha desarrollado resistencia a herbicidas,

-al menos un recipiente.

14. Kit de ensayo según la reivindicación 13, que comprende además uno o más de los componentes seleccionados del grupo de -al menos un reactivo químico, -al menos un mortero con mano de mortero y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una 40 prensa manual -al menos una pipeta,

- al menos una lámpara UV, -al menos un calentador y/o al menos una cubierta caliente compuesta por reactivos químicos y disolventes,

-al menos una balanza,

- al menos unas tijeras,

- al menos un par de pinzas,

- al menos una bolsa de plástico,

- al menos una información de identificación para identificar la especie vegetal,

5 -al menos unas instrucciones que describen cómo usar el kit de ensayo,

- al menos una jeringa,

- al menos un filtro

- al menos una placa de cromatografía en capa fina.

15. Kit de ensayo según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho kit comprende

10 -3 trozos de papel de filtro,

- 3 cajas con tapas y cada una con 4 bolas de vidrio

- 6 vidrios,

- 3 jeringas cada una con 13, 5 ml de disolvente,

- 1-3 recipientes con reactivos químicos,

15 -3 pipetas,

- 1 balanza,

- 1 tijera,

- 1 par de pinzas,

- 3 bolsas de plástico,

20 -1 información de identificación para identificar la especie vegetal,

- 1 instrucciones que describen cómo usar el kit de ensayo incluyendo una escala de colores convencional,

- 3 filtros.

16. Uso del kit de ensayo según las reivindicaciones 12-15, para someter a prueba la resistencia a herbicidas

en plantas.

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