Procedimiento y kit para probar si una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico.

Un procedimiento para probar si material de una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico,

comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) obtener material de una planta específica,

b) preparar una suspensión líquida de la planta específica de a) en el que la suspensión líquida de la planta específica comprende al menos un compuesto fitoquímico,

c) detectar los compuestos fitoquímicos en la suspensión líquida de b) por su color de luz visible y/o UV, en el que la detección se realiza sin separación de dichos compuestos fitoquímicos,

d) correlacionar dicho color de los compuestos fitoquímicos detectados con una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para combinaciones de planta específica y pesticida específico,

e) evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico.

Procedimiento y kit para probar si una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento y un kit para la detección de efectos de pesticidas en plantas antes de cualquier signo visual, es decir, los signos morfológicos son detectables en la planta. Más específicamente, la 5 invención se refiere a un procedimiento simple y rápido de detección de compuestos químicos en plantas vivas expuestas a pesticidas que incluyen herbicidas. El kit y procedimiento se correlacionan con compuestos fitoquímicos que no se han separado con exposición de una planta a pesticidas o herbicidas. El kit proporciona un procedimiento simple y rápido de detección de efectos de pesticidas y herbicidas en el campo.

Antecedentes de la invención 10

Las plantas y animales se exponen a estrés continuamente o temporalmente durante su tiempo de vida. Se sabe que diferentes tipos de estrés, diferentes tiempos de exposición y diferentes cantidades de un único tipo de estrés pueden influir de forma diferente dependiendo de las especies de plantas o animales.

Se han usado compuestos fitoquímicos como biomarcadores para obtener un patrón de biomarcador (documento WO 01/92879) . Un patrón de biomarcador en plantas se define como los cambios en la composición y contenido de los 15 compuestos fitoquímicos detectados en plantas después de la exposición a herbicidas.

La detección y/o predicción de los efectos de pesticidas finales en plantas es de especial interés para la industria agropecuaria, principalmente para reducir y controlar el uso de productos químicos tales como pesticidas. Puede realizarse una reducción y/o control de la cantidad de pesticidas usados cuando los efectos de pesticidas puedan detectarse y/o predecirse poco tiempo después de la exposición al pesticida. 20

La presente invención desvela un procedimiento simple, rápido y altamente sensible de prueba de los efectos finales de productos químicos en plantas poco tiempo después de la exposición a productos químicos tales como pesticidas. El procedimiento aprovecha un cambio en la composición de los compuestos químicos y estos compuestos pueden usarse como biomarcadores en el material de una planta cuando se expone a estrés. Particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento de prueba de los efectos no visuales, además de los visuales, sobre plantas 25 expuestas a estrés químico producido por pesticidas.

Resumen de la invención La invención se refiere a un procedimiento simple y rápido para probar si material de una planta específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) obtener material de una planta específica, 30

b) preparar una suspensión líquida de la planta específica de a) en el que la suspensión líquida de la planta específica comprende al menos un compuesto fitoquímico,

c) detectar los compuestos fitoquímicos en la suspensión líquida de b) por su color de luz visible y/o UV, en el que la detección se realiza sin separación de dichos compuestos fitoquímicos,

d) correlacionar dicho color de los compuestos fitoquímicos detectados con una escala estándar de colores de luz 35 visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la planta específica y el pesticida específico,

e) evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de una escala estándar para evaluar si una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) someter una planta viva específica a un pesticida específico, 40

b) obtener material de la planta expuesta de a) ,

c) determinar respuestas químicas de la planta específica por una detección de color de luz visible y/o UV sin realizar una separación de los compuestos fitoquímicos de la planta,

d) obtener una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de los compuestos fitoquímicos no separados para la combinación de planta específica y pesticida específico. 45

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de ensayo para su uso en el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho kit:

- al menos un papel de filtro,

- al menos un disolvente,

- al menos un medio para estrujar, 5

- al menos una escala de visualización convencional de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la detección y/o predicción de la exposición a un pesticida específico,

- al menos un recipiente.

Descripción de los dibujos Figura 1. Intensidad de color de dos tipos diferentes de tiras (tira A y B) de material de planta en relación con la tasa de 10 exposición a diferentes herbicidas y correlacionada con el crecimiento reducido de las plantas (peso fresco y seco) . Los colores PANTONE® (indicados en las columnas) , la intensidad (AU) (indicada por la altura de las columnas) calculada en el equipo CAMAG y el crecimiento reducido (peso fresco y seco (indicados por las gráficas) ) como el 100 % - el peso relativo calculado 21 días después de la exposición: Apera spica-venti 4 y 7 días después de la exposición a los herbicidas Hussar (fig. 1e y fig. 1f) , Atlantis (fig. 1a y fig. 1b) , Monitor (fig. 1g y fig. 1h) y Lexus (fig. 1m y fig. 1n) ; Lolium 15 perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar (fig. 1 y fig. 1) ; Poa annua 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis (fig. 1c y fig. 1d) ; Alopecurus myosuroides 4 y 7 días después de la exposición al herbicida Lexus (fig. 1k y fig. 1I) y Bromus hordeaceus 4 y 7 días después de la exposición al herbicida Monitor (fig. 1i y fig. 1j) . La descripción de los colores de las tiras y, por tanto, de las columnas de la figura puede verse de la tabla 4 y 5 en las que también se indica el número de color según la escala de color Pantone. La intensidad de color indica el nivel 20 de los compuestos probados por cada prueba, y cuanto más oscuro sea el color, más es el material de planta afectado por el tratamiento con herbicida.

Figura 2. Resultados del estudio nº 972/04. Ballico perenne (Lolium perenne) expuesto a Hussar (1 N = 200 g/ha) con tratamiento con lluvia 0, 1 y 4 horas después de la aplicación. ▲ = % de efecto (peso fresco) , • = % de efecto (peso seco) . Fig. 2a: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar sin aditivo y sin lluvia; fig. 2b: Lolium 25 perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar con aditivo y sin lluvia; fig. 2c: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar sin aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 2d: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar con aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 2e: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar sin aditivo y lluvia después de 4 horas; fig. 2f: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Hussar con aditivo y lluvia después de 4 horas. Se da más información en los 30 ejemplos. Para una descripción de las columnas y gráficas véase la leyenda para la figura 1.

Figura 3: Resultados del estudio nº 946/06. Ballico perenne (Lolium perenne) expuesto a Atlantis y sin lluvia o con lluvia 1 o 3 horas después de la aplicación. 1N: 480 g/ha de Atlantis solo y sin lluvia, 1920 g/ha con lluvia, 120 g/ha con aditivo y sin lluvia, 960 g/ha con aditivo y con lluvia. ▲ = % de efecto (peso fresco) , • = % de efecto (peso seco) . fig. 3a: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y sin lluvia; fig. 3b: Lolium perenne 4 35 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y sin lluvia; fig. 3c: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y sin lluvia; fig. 3d: Lolium perenne 74 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y sin lluvia; fig. 3e: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 3f: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y lluvia después de 1 hora. fig. 3g: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin 40 aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 3h: Lolium perenne 7 días después de la exposición al herbicida Atlantis con aditivo y lluvia después de 1 hora; fig. 3i: Lolium perenne 4 días después de la exposición al herbicida Atlantis sin aditivo y lluvia después de 3 horas; fig.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para probar si material de una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) obtener material de una planta específica,

b) preparar una suspensión líquida de la planta específica de a) en el que la suspensión líquida de la planta específica 5 comprende al menos un compuesto fitoquímico,

c) detectar los compuestos fitoquímicos en la suspensión líquida de b) por su color de luz visible y/o UV, en el que la detección se realiza sin separación de dichos compuestos fitoquímicos,

d) correlacionar dicho color de los compuestos fitoquímicos detectados con una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para combinaciones de planta específica y pesticida 10 específico,

e) evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de evaluar si la planta específica se ha expuesto al pesticida específico (a) al menos un reactivo químico se selecciona de uno o más de los siguientes compuestos: 15

Vainillina, ácido sulfúrico, naftoresorcinol, azul de metileno, β-naftol, timol, fluoresceína, amoniaco, verde de bromocresol, azul de bromofenol, permanganato de potasio, 2, 7-diclorofluoresceína, rodamina 6G, éster 2-aminoetílico de ácido difenilbórico, ácido fosfórico, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdatoestaño (II) , cloruro de cobalto (II) , cloruro de paladio (II) , ninhidrina, 1-naftol, nitrato de bismuto (III) , yoduro de potasio, molibdato ácido fosfórico, rodamina B, anisaldehído, nitrato de plata, cloruro de hierro (III) , cloruro de cinc, rojo de clorofenol, rojo de 20 metilo, rojo de etilo, azul de bromotimol, sal sódica de 2, 6-diclorofenolindofenol, púrpura de bromocresol, hidróxido potásico, glucosa, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, 2, 4-dinitrofenilhidracina, cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, hidróxido de tetrabutilamonio, yodo, sulfato férrico (III) amoniacal, 2-metoxi-2, 4-difenil-3 (2H) furanona (MDPF) , borinato de 2-aminoetil-difenilo, cloruro de aluminio, cloruro de berberina deshidratado, sal sódica de 1, 2-naftoquinon-4-sulfona, antrona, 8-hidroxiquinolina, 2-aminodifenil (bifenil-2-amina) , orcinol, urea, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-25 aminobenzoico, ácido molibdatofosfórico, 2', 7'-diclorofluoresceína, sal de amonio de ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, rodamina, nitrato de bismuto (III) , yoduro de potasio y productos químicos o mezclas de los mismos, con al menos un grupo de dichos compuestos químicos que pueden o pueden no estar presentes en dicho material de planta, y

(b) provocar una reacción química entre dicho al menos un reactivo químico y los compuestos fitoquímicos no 30 separados del material de planta,

(c) detectar el resultado de la reacción química de la etapa (b) por luz visible y/o UV, sin realizar una separación de los compuestos fitoquímicos,

(d) correlacionar los resultados de la etapa (c) con un resultado de escala estándar desarrollado con respecto a la planta específica. 35

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además i) poner en contacto la suspensión líquida del material de planta con un reactivo químico, provocando así una reacción química entre la suspensión líquida del material de planta y el reactivo químico, y

ii) poner en contacto un soporte sólido con el material de planta químicamente reaccionado con los productos químicos de i) , obteniendo así un soporte sólido con un color e intensidad de color. 40

4. Un procedimiento de preparación de una escala estándar para evaluar si una planta viva específica se ha expuesto a un pesticida específico, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) someter una planta viva específica a un pesticida específico,

b) obtener material de la planta expuesta de a) ,

c) determinar respuestas químicas de la planta específica por una detección de color por luz visible y/o UV sin realizar 45 una separación de los compuestos fitoquímicos de la planta,

d) obtener una escala estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la combinación de planta específica y pesticida específico.

5. Un kit de ensayo para su uso en el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho kit:

- al menos un papel de filtro, 5

- al menos un disolvente,

- al menos un medio para estrujar,

- al menos una escala de visualización estándar de colores de luz visible y/o UV únicos de compuestos fitoquímicos no separados para la detección y/o predicción de la exposición de una planta viva específica a un pesticida específico,

- al menos un recipiente. 10

6. El kit de ensayo según la reivindicación 5, que comprende además uno o más de los componentes seleccionados del grupo que consiste en:

- al menos un reactivo químico, en el que dicho reactivo químico se selecciona de uno o más de los compuestos:

Vainillina, ácido sulfúrico, naftoresorcinol, azul de metileno, β-naftol, timol, fluoresceína, amoniaco, verde de bromocresol, azul de bromofenol, permanganato de potasio, 2, 7-diclorofluoresceína, rodamina 6G, éster 2-aminoetílico 15 de ácido difenilbórico, ácido fosfórico, yodo, yoduro de potasio, cloruro de amoniomolibdatoestaño (II) , cloruro de cobalto (II) , cloruro de paladio (II) , ninhidrina, 1-naftol, nitrato de bismuto (III) yoduro de potasio, molibdato ácido fosfórico, rodamina B, anisaldehído, nitrato de plata, cloruro de hierro (III) , cloruro de cinc, rojo de clorofenol, rojo de metilo, rojo de etilo, azul de bromotimol, sal sódica de 2, 6-diclorofenolindofenol, púrpura de bromocresol, hidróxido potásico, glucosa, 4-cloro-7-nitrobenzofurazano, 2, 4-dinitrofenilhidracina, cloroformiato de 9-fluorenilmetilo, hidróxido de 20 tetrabutilamonio, yodo, sulfato férrico (III) amoniacal, 2-metoxi-2, 4-difenil-3 (2H) furanona (MDPF) , borinato de 2-aminoetil-difenilo, cloruro de aluminio, cloruro de berberina deshidratado, sal sódica de 1, 2-naftoquinon-4-sulfona, antrona, 8-hidroxiquinolina, 2-aminodifenil (bifenil-2-amina) , orcinol, urea, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-aminobenzoico, ácido molibdatofosfórico, 2', 7'-diclorofluoresceína, sal de amonio de ácido 8-anilinonaftaleno-1-sulfónico, rodamina, nitrato de bismuto (III) , yoduro de potasio y productos químicos o mezclas de los mismos, 25

- al menos un mortero con pistilo y/o al menos una caja con bolas para agitar y/o al menos una prensa de mano

- al menos una pipeta,

- al menos una lámpara de UV,

- al menos un calentador y/o al menos una cobertera caliente hecha de reactivos químicos y disolventes,

- al menos una balanza, 30

- al menos unas tijeras,

- al menos un par de pinzas,

- al menos una bolsa de plástico,

- al menos una información de identificación para identificar especies de plantas,

- al menos una instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo, 35

- al menos una jeringa,

- al menos un filtro.

7. El kit de ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que dicho kit comprende • 3 trozos de papel de filtro,

• 3 recipientes con tapas y cada uno con 2, 3 o 4 bolas de vidrio 40

• 6 vasos,

• 3 jeringas cada una con, por ejemplo, 13, 5 ml de disolvente,

• 1-3 recipientes con reactivos químicos,

• 3 pipetas,

• 1 balanza,

• 1 tijeras,

• 1 par de pinzas, 5

• 3 bolsas de plástico,

• 1 información de identificación para identificar especies de plantas,

• 1 instrucción que describe cómo usar el kit de ensayo que incluye una escala de color estándar, y

• 3 filtros.

8. Uso de un procedimiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para determinar si una 10 planta de cultivo viva o planta de mala hierba viva específica se ha sometido a un pesticida específico.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el uso según la reivindicación 8, en el que el pesticida específico es un herbicida.

10. El procedimiento o el uso según la reivindicación 9, en el que el herbicida es un herbicida de sulfonilurea.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el uso según la reivindicación 8, en el que la 15 planta específica se selecciona del grupo que consiste en Apera spica venti, Lolium perenne, Poa annua y Bromus hordeaceus.