Modelo de aterosclerosis en cerdos.

Un cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado como un modelo para estudiar la aterosclerosis,

en el que el modelo de cerdo expresa al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis.

y comprende al menos una mutación en el

i. gen ApoE endógeno y/o

ii. gen receptor del LDL endógeno,

en la que dicho fenotipo al menos es hipercolesterolemia.

Modelo de aterosclerosis en cerdos Campo de la invención

La presente invención se refiere un cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado como un modelo para estudiar la aterosclerosis, en la que el modelo de cerdo de tamaño miniatura expresa al menos un fenotipo asociado con dicha enfermedad. La invención se refiere además a procedimientos mediante los que se obtiene el cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado. Además, se describen procedimientos para evaluar la respuesta de un tratamiento terapéutico de la aterosclerosis, para cribar la eficacia de una composición farmacéutica, y un procedimiento para el tratamiento de un ser humano que padece de aterosclerosis.

Antecedentes de la invención

Animales transgénicos, no humanos, pueden ser utilizados para comprender la acción de un único gen o genes en el contexto del animal completo y los fenómenos interrelacionados de la activación, expresión e interacción del gen. La tecnología ha llevado también a la obtención de modelos para varias enfermedades en humanos y otros animales que contribuye significativamente a una mejor comprensión de los mecanismos genéticos y de los genes asociados con enfermedades específicas.

Tradicionalmente, se han utilizado animales más pequeños tal como ratones como modelos de enfermedades para las enfermedades humanas y se ha encontrado que son adecuados como modelos para ciertas enfermedades. Sin embargo, su valor como modelos animales para muchas enfermedades humanas es bastante limitado debido a diferencias en los ratones comparados con los humanos. Los animales transgénicos más grandes son mucho más adecuados que los ratones para el estudio de muchos de los resultados y tratamientos de la mayoría de las enfermedades humanas debido a su mayor similitud con los humanos en muchos aspectos. Particularmente, se cree que los cerdos son valiosos como modelos de enfermedades para las enfermedades humanas.

La aterosclerosis es, con mucho, la causa más frecuente de arteriopatía coronaria (angina de pecho, infarto de miocardio y muerte súbita), de arteriopatía carótida (accidente cerebrovascular), y de arteriopatía periférica. La aterosclerosis se conoce como el "endurecimiento de las arterias" que es causado por la formación de numerosas placas dentro de las arterias.

Es una enfermedad inflamatoria crónica, que se nutre de altos niveles de plasma de lipoproteínas ricas en colesterol, que llevan al desarrollo de placas ateroscleróticas de células inflamatorias, desechos y células del músculo liso en arterias1 de tamaño grande y mediano. Estas lesiones raramente presentan síntomas por sí mismas. El proceso mecánico en el que las placas se abren reventando, conocido como rupturas de la placa, causa las consecuencias devastadoras de la aterosclerosis. Mediante este proceso, el núcleo trombogénico de la placa es expuesto al sistema hemostático de la sangre en circulación y esto puede provocar un trombo agudo superpuesto limitante del flujo.

En la mayoría de casos de aterosclerosis el componente genético es complejo, pero en algunos casos la herencia de la enfermedad es monogénica. Estos casos se deben principalmente a mutaciones en los genes que codifican las proteínas implicadas en el tráfico de lipoproteínas, y las más graves en humanos son causadas por mutaciones nulas del homozigoto en el receptor de LDL (hipercolesterolemia familiar del homozigoto). Aunque el proceso de la enfermedad en la deficiencia del receptor LDL del homozigoto es enormemente agresivo conduciendo a una aterosclerosis coronaria grave en la infancia, se considera que la enfermedad no es cualitativamente diferente de lo visto en la aterosclerosis de desarrollo más lento. Por ello, las causas monogénicas de la aterosclerosis pueden utilizarse como herramientas para modelizar la aterosclerosis y las complicaciones ateroscleróticas en modelos animales genéticamente modificados.

Ratones deficientes en apolipoproteína E y en receptor de LDL con grave hipercolesterolemia y rápido desarrollo de la aterosclerosis se crearon a principios de la década de 1990 por recombinación homologa en células6,7 madre embrionarias. Estos modelos de ratón han contribuido a comprender muchos aspectos del desarrollo de la placa, pero se consideran limitados como modelos para la aterosclerosis humana porque carecen de aterosclerosis coronaria medible y no desarrollan la mayoría de las temidas complicaciones de la aterosclerosis, es decir, la ruptura de la placa aterosclerótica y la trombosis superpuesta. Además, debido a su pequeño tamaño, estos animales no han ayudado a la investigación por bioimágenes de la aterosclerosis y en la intervención coronaria percutánea.

Las similitudes en la estructura cardiovascular y en la distribución de las arterias coronarias con los humanos hacen del cerdo una especie interesante para explorar la función y las enfermedades cardiovasculares. En dietas convencionales (~3 % de grasa, peso/peso), los cerdos tienen bajos niveles de colesterol en plasma (~2 mmol/l), pero muchas razas de cerdos son susceptibles de hipercolesterolemia y aterosclerosis moderada cuando son alimentados con una dieta alta en grasa saturada y colesterol, incluidos los cerdos9 de granja de tamaño miniatura Yucatán8 y Yorkshire. Los cerdos de tamaño miniatura Yucatán tienen particular interés como modelos de la aterosclerosis humana porque su peso de adulto es comparable con el de los humanos (60-80 kg para los machos y 50-70 kg para las hembraslO) y por ello el equipo para obtener imágenes y la intervención coronaria percutánea

puede utilizarse directamente.

La mayoría de lesiones declaradas hasta la fecha han sido descritas en una progenie de grandes cerdos de granja identificados en Wisconsin que albergan una mutación de sentido erróneo de un único nucleótido en el gen receptor para LDL que reduce la afinidad del receptor con sus ligandos11. Una colonia de estos cerdos es actualmente mantenida en Francia por el profesor Ludovic Drouet, INRA, Jouy en Josas. Los cerdos desarrollan aterosclerosis en las arterias coronarias con muchos aspectos de la aterosclerosis humana incluidas las rupturas de la placa y la trombosis superpuesta. Sin embargo, la hipercolesterolemia es moderada en una dieta normal de un cerdo (colesterol total 5-8 mM) y la aterosclerosis se desarrolla sólo lentamente a lo largo de varios años. Para cuando estos cerdos han desarrollado aterosclerosis son, con mucho, demasiado grandes para la mayoría de los fines científicos.

Aunque en décadas pasadas se han logrado avances considerables en la terapia farmacológica anti-aterosclerótlca, la aterosclerosis sigue siendo una de las principales causas de muerte y dlscapacidad grave en Dinamarca y en el resto del mundo2. Hay al menos tres partes para una explicación de esto.

En primer lugar, el enfoque convencional del factor de riesgo basado en la población recomendado en las directivas oficiales es incapaz de identificar aquellos que necesitan tratamiento a nivel Individual3 Por ello, aunque los autores de la Invención tienen acceso a un tratamiento preventivo eficaz se ven Incapaces de identificar aquellos a los que tratar. Este problema podría resolverse mediante imágenes diagnósticas de la aterosclerosis, que está llegando a ser teóricamente posible con la llegada de la nueva tecnología4,3 de obtención de Imágenes de alta resolución. Sin embargo, para desarrollar agentes trazadores/de contraste y secuencias de Imágenes que sean capaces de visualizar placas ateroscleróticas y actividad de enfermedad aterosclerótlca, los autores de la invención necesitan un modelo animal de la enfermedad de tamaño humano que pueda ser examinado en escáneres con TC, RM y TEP en el paciente.

En segundo lugar, la terapia anti-aterosclerótlca es eficaz en la prevención de la aterosclerosis a largo plazo, pero existe una carencia de terapia médica que sea eficaz en disminuir rápidamente el riesgo de complicaciones trombóticas en personas que han consolidado una aterosclerosis grave. P. ej., en aquellas personas que han identificado por sí mismos presentar síntomas de aterosclerosis y en las que se promueve el máximo tratamiento, todavía pueden tener lugar futuros acontencimientos. En la actualidad, el principal obstáculo para desarrollar tal medicina es la carencia de un modelo animal en el que tengan lugar la ruptura de la placa y la trombosis arterial.

En tercer lugar, el mejor tratamiento para acontecimientos coronarios en la actualidad es principalmente la intervención coronaria percutánea con la colocación de un estent, pero estos procedimientos están sujetos a complicaciones incluidas la trombosis del estent y la restenosis intra-estent. La mayor parte de la investigación dentro de esta importante... [Seguir leyendo]

1. Un cerdo de tamaño miniatura genéticamente modificado como un modelo para estudiar la aterosclerosis, en el que el modelo de cerdo expresa al menos un fenotipo asociado con la aterosclerosis.

y comprende al menos una mutación en el

i. gen ApoE endógeno y/o

ii. gen receptor del LDL endógeno,

en la que dicho fenotipo al menos es hipercolesterolemia.

2. El cerdo modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cerdo de tamaño miniatura se selecciona del grupo constituido por Goettingen, Yucatán, Bama Xiang Zhu, Wuzhishan y Xi Shuang Banna, incluida cualquier

combinación de los mismos.

3. Un blastocisto porcino genéticamente modificado derivado del modelo de cerdo genéticamente modificado como se define en la reivindicación 1.

4. Un embrión porcino genéticamente modificado derivado del modelo de cerdo genéticamente modificado como se define en la reivindicación 1.

5. Un feto porcino genéticamente modificado derivado del modelo de cerdo genéticamente modificado como se

define en la reivindicación 1.

6. Una célula y/o núcleo de célula donante porcina genéticamente modificada derivada del modelo de cerdo genéticamente modificado como se define en la reivindicación 1

7. Un procedimiento para evaluar el efecto de un tratamiento terapéutico de la aterosclerosis, comprendiendo dicho

procedimiento las etapas de

i) proporcionar el modelo de cerdo de acuerdo con la reivindicación 1,

ii) evaluar el efecto observado en dicho modelo de cerdo tratado con una composición farmacéutica.

8. Un procedimiento para cribar la eficacia de una composición farmacéutica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

i) proporcionar el modelo de cerdo de acuerdo con la reivindicación 1,

ii) que expresa en dicho modelo de cerdo dicho determinante genético y que utiliza dicho fenotipo de dicha enfermedad,

iii) evaluar el efecto, si lo hay, en dicho modelo de cerdo tratado con dicha composición farmacéutica.