La presente solicitud de patente se refiere a un método calorimétrico y kit para la detección y cuantificación de receptores aniónicos de alta carga,

como ADN de doble cadena y micelas aniónicas de SDS, mediante agregados de nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs).

Método para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en general en el campo de la analítica y en particular se refiere a un método y kit para la detección y cuantificación de receptores aniónicos de alta carga.

Estado de la técnica

La naturaleza y la fuerza de las interacciones del ADN y de sus componentes (bases y nucleósidos) con nanopartículas metálicas son un tema de gran interés para los investigadores en las interdisciplinas de la nanobiotecnología. Los modos de unión y conformación del ADN y sus componentes en las superficies metálicas sugieren que la interacción ADN-metal es compleja y altamente dependiente de la secuencia. En los últimos años, las nanopartículas metálicas solubles en agua y biocompatibles han recibido una gran atención debido a los posibles beneficios de su aplicación en la biología y la medicina.

Sus propiedades únicas, ópticas y magnéticas, hacen que estos sistemas sean interesantes para las aplicaciones de diagnóstico e imagen. Entre ellos, las nanopartículas de oro se han utilizado ampliamente para la detección colorimétrica de la hibridación de ADN (J. Liu, Y. Lu, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 12677-12683) . Los ensayos de biodetección utilizando nanopartículas de oro funcionarizadas con ADN implican estrategias de lectura colorimétrica. Estos procedimientos se inspiran en la transición del color de la agregación inducida de rojo a azul, debido al desplazamiento de la banda de resonancia de plasmones de superficie de las nanopartículas (SPB) (S. J. Hurst, A. K. R. Lytton-Jean and C. A. Mirkin, Anal. Chem. 2006, 78, 8313-8318) .

El ADN de cadena simple (ssDNA) y doble (dsDNA) tienen inclinaciones diferentes para absorberse a las nanopartículas de oro aniónicas (AuNPs) , debido a sus diferentes interacciones electrostáticas con éstas. El ssDNA se sabe que es capaz de adsorberse sobre las AuNPs y estabilizar suspensiones coloidales en concentraciones salinas (X. Su and R. Kanjanawarut, ACSNano 2009, 3, 2751-2759) . El ssDNA se puede desenrollar lo suficiente como para exponer a sus bases. Por su parte, el dsDNA se caracteriza por su poca afinidad con las AuNPs de carga negativa debido a su estable hebra ADN-ADN de doble hélice, con una geometría tal que siempre tiene aisladas sus bases nitrogenadas y presenta la espina dorsal de fosfatos con carga negativa hacia el exterior. Por esta razón, ADN de doble cadena no puede proteger AuNPs de una agregación inducida por la presencia de sales en el medio, en comparación con el ADN de cadena simple. Esta agregación es perceptible en el cambio de color de la solución coloidal dándose un corrimiento hacia el rojo del pico de la banda SPB.

Así,

Se ha desarrollado un ensayo colorimétrico para la detección de DNA de cadena simple basado en la agregación de nanopartículas metálicas sin modificaciones (nanopartículas aniónicas con iones citrato) (R. Kanjanawarut and X. Su, Anal. Chem. 2009, 81, 6122-6129) . El método es válido para ADN de cadena simple, y para los ácidos nucleicos peptídicos (ANP) , que son análogos de ADN en el que se sustituye la columna vertebral de todo el contenido de azúcarfosfato por una columna vertebral de poliamida de carga neutra.

El ADN de doble cadena no se absorbe debido a la repulsión entre la espina dorsal del fosfato cargado del ADN de doble cadena y los iones citrato adsorbidos. Por el contrario, gracias a su flexibilidad, ssDNA, puede parcialmente desenrollar sus bases, para que puedan estar expuestas a las nanopartículas de oro. En estas condiciones, la carga negativa de la columna vertebral se encuentra a una distancia suficiente de las AuNPs dándose fuerzas atractivas de van der Waals entre las bases y las nanopartículas de oro, suficientes para lograr que el ADN de cadena simple se una al oro. Este mecanismo no es operativo con ADN de doble cadena, porque la estructura de doble cadena no permite el desenrollamiento necesario para exponer las bases. Esto permite la determinación de si ssDNA está presente o no en una disolución. Mientras que los cambios de color de una disolución provocados por la adición de aditivos tales como NaCl son retrasados si la solución contiene ssDNA (impide la agregación de las nanoparticulas por la sal) , la alteración del color no se ve retardada cuando las solución contiene ADN de doble cadena. (S. Rho, S. J. Kim, S. C. Lee, J. H. Chang, H. G. Kang and J. Choi, Curr. Appl. Phys. 2009, 9, 534-537) .

La detección de ADN de cadena simple solo es posible a través de un mecanismo de agregación con las nanopartículas (cross-linking) . Los métodos clásicos no son válidos para la detección de ADN de doble cadena ya que la doble hebra no se adsorbe sobre el nanocluster.

Existe pues la necesidad de proporcionar un método de alta sensibilidad, sencillez y con un tiempo corto de respuesta que permita la detección de ADN de cadena doble.

Explicación de la invención

Así pues, la presente invención en un primer aspecto se refiere a un método colorimétrico para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos de alta carga que comprende:

a) añadir nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) a una muestra problema. b) determinar el grado de desagregación de las nanopartículas mediante la medida de la relación de absorbancia a 520nm y 560 nm.

donde la desagregación de las nanopartículas es indicativa de la presencia de polielectrolito aniónico en la muestra.

En un aspecto más en particular de la presente invención, previamente al paso a) , hay un paso de inducción de la agregación de las nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) mediante la adición de un electrolito.

En un aspecto más en particular de la presente invención, el polielectrolito aniónico de alta carga es ADN de cadena doble.

En otro aspecto más en particular de la presente invención el polielectrolito aniónico de alta carga son micelas aniónicas, más en particular, son micelas aniónicas de SDS.

En un aspecto más en particular de la presente invención, las nanopartículas se agregan con NaCl.

En un aspecto más en particular de la presente invención, el tamaño de las nanopartículas de oro protegidas con iones citrato tienen un tamaño comprendido entre 3-20 nm.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos de alta carga que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el método descrito anteriormente.

En un aspecto más en particular de la presente invención, el kit comprende

- Nanopartículas de oro

- Cloruro sódico

En un aspecto más en particular, el kit además comprende citrato.

En otro aspecto en particular, el kit de la presente invención comprende nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) y cloruro sódico.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit según se ha descrito anteriormente, para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos de alta carga.

Descripción de las figuras

Figura 1: Muestra los modelos de detección de ADN de doble cadena: AuNPs agregadas (B) y no agregadas (A) .

Figura 2: Muestra UV-VIS de absorción de las AuNPs (5nm de diámetro) en presencia de diferentes concentraciones de ADNdssy a una concentración de NaCl de 0.5 M. Las curvas corresponden a .: AuNPs con sal, T: AuNPs 0.54 μM, e AuNPs 215 μM, .: AuNPs 1x10-3 M y +: 1.7x10-3 M (4) de dsDNA. [AuNPs] = 7.5x10-9 M en cada caso, la línea de puntos se corresponde a las AuNPs sin sal.

Figura 3. Muestra el grado de desagregación (medido como A520/A560) frente a las concentraciones de ADN de doble cadena. Puntos circulares corresponden a los puntos de NaCl 0, 5 M. Puntos triangulares corresponden a NaCl 1M. A medida que aumenta la concentración de sal, se necesita más cantidad de ADN de doble cadena para que la SPB recupere su posición inicial.

Figura 4. (A) Muestra la absorbancia (a 560 nm) frente al tiempo para la agregación de las partículas de oro por NaCl 1M. (B) Muestra la absorción (a 560 nm) para la desagregación de nanopartículas de...

1. Método colorimétrico para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos de alta carga que comprende:

c) añadir nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) agregadas a una muestra problema

d) determinar el grado de desagregación de las nanopartículas mediante la medida de la relación de absorbancia a 520nm y 560 nm.

donde la desagregación de las nanopartículas es indicativo de la presencia de polielectrolito aniónico en la muestra.

2. Método según la reivindicación 1, donde previamente al paso a) , se induce la agregación de las nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) mediante la adición de un electrolito.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el polielectrolito aniónico de alta carga es ADN de cadena doble.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el polielectrolito aniónico de alta carga son micelas aniónicas

5. Método según la reivindicación 4, donde las micelas son micelas aniónicas de SDS.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el electrolito es NaCl.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tamaño de las nanopartículas de oro protegidas con iones citrato tienen un tamaño comprendido entre 3-20 nm.

8. Kit para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos de alta carga que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Kit según la reivindicación 8, que comprende

- Nanoparículas de oro

- Cloruro sódico

10. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, que comprende citrato.

11. Kit según la reivindicación 8, que comprende nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) y cloruro sódico.

12. Uso de un kit según las reivindicaciones 8-11 para la detección y/o cuantificación de polielectrolitos aniónicos de alta carga.