Inmunocitocinas con selectividad modulada.

Proteína de fusión que comprende una fracción de dominio de anticuerpo fusionada a una fracción IL-2 mutante en donde la fracción IL-2 mutante comprende una sustitución de aminoácido que cambia un ácido aspártico a una treonina en una posición correspondiente a la posición 20 (D20T) de la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-2 humana madura establecida en la secuencia ID NO:

3, en donde la proteína de fusión exhibe mayor selectividad que una proteína de referencia hacia células que expresan un receptor de alta afinidad, en donde dicha proteína de referencia comprende la fracción de dominio de anticuerpo fusionada a una fracción IL-2 no mutante, y en donde dicha selectividad se mide como una relación de activación de células que expresan el receptor IL-2Rαβγ con respecto a la activación de células que expresan el receptor IL-2Rβγ.

Inmunocitocinas con selectividad modulada.

Campo de la invención La presente invención hace referencia en general a proteínas de fusión que contienen una citocina, y métodos para incrementar la efectividad terapéutica de tales proteínas de fusión. Más específicamente, la presente invención hace referencia a proteínas de fusión de citiocinas que exhiben una vida media de circulación más larga en el cuerpo de un paciente que la citocina que se presenta de manera natural y que tienen propiedades terapéuticas mejoradas. En particular, la invención hace referencia a la proteína de fusión IL2 con características terapéuticas mejoradas.

Antecedentes La interleucina-2 (IL-2) es una citocina potente que actúa en el sistema inmune para generar principalmente una respuesta inmune mediada por células. Bajo las condiciones apropiadas, IL-2 se produce a nivel local a altas concentraciones cerca del sitio de un antígeno para suministrar las señales co-estimuladoras necesarias para generar una respuesta inmune al antígeno. Debido a su rol en el crecimiento y diferenciación de los linfocitos T, IL-2 ha sido candidata en enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento de tumores. Además de estimular los linfocitos T, también se demostró que IL-2 estimula las células B, células NK, linfocitos agresores activados por linfocina (LAK, por sus siglas en inglés) , monocitos, macrófagos y células dendríticas.

IL-2 es un agente terapéutico aprobado para el tratamiento de carcinoma renal metastásico y melanoma metastásico pero su utilización está restringida debido a los graves efectos secundarios tóxicos, que incluyen fiebre, náuseas, fuga vascular e hipotensión. Entre los diferentes efectos tóxicos observados con la administración de IL-2, el efecto tóxico menos deseable y el que se cree que interfiere de manera sustancial con la terapia de IL-2 es el síndrome de fuga vascular (VLS, por sus siglas en inglés) y las complicaciones asociadas con el mismo.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en el arte de mejorar más aún la utilidad terapéutica de las proteínas IL-2.

Resumen de la invención La presente invención se basa, en parte, en la identificación de mutaciones en la fracción IL-2 de una proteína de fusión IL-2 para incrementar la dosis máxima tolerada de la proteína relativa a la dosis de máxima efectividad para esa proteína cuando se administra a un paciente. Las proteínas de fusión preferentes son capaces de unirse mediante interacciones diferentes a más de una especie de receptor expresado en la misma célula del cuerpo del paciente. Las proteínas de fusión de citocina preferentes incluyen una citocina que es capaz de unirse a más de un tipo de complejo receptor de citocina y a más de un tipo de célula. La invención también proporciona métodos para identificar variantes de proteína de fusión de citocina particulares con propiedades útiles.

La presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden una fracción de dominio de anticuerpo fusionada a una fracción IL-2 mutante, donde la proteína de fusión exhibe una mayor selectividad que una proteína de referencia incluyendo la fracción que no es IL-2 fusionada a una fracción de dominio de anticuerpo, y donde la selectividad se mide como una relación de activación de células que expresan el receptor IL-2Raºy con respecto a la activación de células que expresan el receptor IL-2Rºy.

La fracción IL-2 mutante de las proteínas de fusión incluye una mutación en la proteína IL-2 humana madura. En una realización, las proteínas de fusión según la invención incluyen una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos en la fracción IL-2. En otra realización, las proteínas de fusión de la invención incluyen modificaciones de uno o más aminoácidos en la fracción IL-2 de las proteínas de fusión.

Las mutaciones en las proteínas de fusión de la invención alteran la selectividad de las proteínas de fusión con respecto a una proteína de fusión de referencia, donde la selectividad se mide como una relación de activación de células que expresan el receptor IL-2Raºy con respecto a la activación de células que expresan el receptor IL2Raºy. Las mutaciones en las proteínas de fusión también pueden resultar en un efecto diferencial en la afinidad de las proteínas de fusión por el receptor IL-2Rºy con respecto a la afinidad de las proteínas de fusión por el receptor IL-2Raºy. Las mutaciones o alteraciones preferentes reducen una activación de proteínas de fusión de células que expresan el receptor IL-2Rºy con respecto a la activación de proteínas de fusión de células que expresan el receptor IL-2Raºy.

Las proteínas de fusión preferentes de la invención generalmente exhiben un efecto diferencial que es mayor que aproximadamente el doble. En un aspecto, el efecto diferencial se mide mediante la respuesta proliferativa de células o líneas celulares que dependen de IL-2 para el crecimiento. Esta respuesta a las proteínas de fusión se expresa como un valor ED50, que se obtiene mediante el trazado de una curva de respuesta a la dosis y mediante el cálculo de la concentración de proteína que resulta en una respuesta media máxima. La relación entre los valores ED50 obtenidos para las células que expresan el receptor IL-2Rºy y las células que expresan el receptor IL-2Raºy para una proteína de fusión de la invención con respecto a la relación de valores ED50 para una proteína de fusión de referencia da una medida del efecto diferencial para la proteína de fusión.

La selectividad de las proteínas de fusión de la invención puede medirse frente una proteína de fusión de referencia que comprende la misma fracción de dominio de anticuerpo que en una proteína de fusión fusionada a una fracción de IL-2 no mutante. En una realización preferente, un efecto diferencial medido para las proteínas de fusión de la invención, como se describe con anterioridad, es de entre aproximadamente 5 y 10 veces. De manera preferente, el efecto diferencial que exhiben las proteínas de fusión de la invención se encuentra entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1000 veces.

En una realización preferente alternativa, la selectividad de la proteína de fusión se compara con la selectividad de una proteína de fusión de referencia que comprende la misma fracción que no es IL-2 que en la proteína de fusión fusionada con una fracción IL-2 incluyendo IL-2 humana madura con una sustitución de aminoácido en la posición 88 con un cambio de una asparagina a una arginina (N88R) . Las proteínas de fusión de la invención que tienen un índice terapéutico mejorado incluyen proteínas de fusión que tienen una selectividad cercana a la de N88R pero entre aproximadamente 0, 1% y aproximadamente 100% de la selectividad de una proteína de fusión de referencia con la sustitución de aminoácido N88R. En otra realización, las proteínas de fusión de la invención tienen una selectividad entre aproximadamente 0, 1% y aproximadamente 30% de la selectividad de una proteína de fusión de referencia con la sustitución de aminoácido N88R en la fracción IL-2. Las proteínas de fusión de la invención también incluyen proteínas de fusión que tienen una selectividad de entre aproximadamente 1% y aproximadamente 20% de la selectividad de la proteína de fusión de referencia con la sustitución de aminoácido N88R en la fracción IL-2. La selectividad de las proteínas de fusión de la invención también puede ser de entre aproximadamente 2% y aproximadamente 10% de la selectividad de la proteína de fusión de referencia que incluye la sustitución de aminoácido N88R en la fracción IL-2 humana madura.

Las proteínas de fusión de la invención tienen una vida media en suero que es mayor que la vida media en suero de la proteína IL-2 humana madura. La larga vida media en suero de las proteínas de fusión de la invención puede atribuirse a la fracción de dominio del anticuerpo de la proteína de fusión. En una realización, la fracción de dominio de anticuerpo de una proteína de fusión de la invención incluye, por ejemplo, variantes del dominio de anticuerpo KS-1/4, variantes del dominio de anticuerpo NHS76 y variantes del dominio del anticuerpo 14.18. El dominio del anticuerpo también puede seleccionarse a partir de una variedad de otros anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos contra diversos tumores y antígenos virales.

En una realización preferente, un efecto diferencial medido para las proteínas de fusión de la invención, como se describe con anterioridad,... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión que comprende una fracción de dominio de anticuerpo fusionada a una fracción IL-2 mutante en donde la fracción IL-2 mutante comprende una sustitución de aminoácido que cambia un ácido aspártico a una treonina en una posición correspondiente a la posición 20 (D20T) de la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-2 humana madura establecida en la secuencia ID NO: 3, en donde la proteína de fusión exhibe mayor selectividad que una proteína de referencia hacia células que expresan un receptor de alta afinidad, en donde dicha proteína de referencia comprende la fracción de dominio de anticuerpo fusionada a una fracción IL-2 no mutante, y en donde dicha selectividad se mide como una relación de activación de células que expresan el receptor IL-2Raº y con respecto a la activación de células que expresan el receptor IL-2R y.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde dicha selectividad hacia las células que expresan un receptor de alta afinidad se encuentra entre el 0, 1% y el 100% de selectividad de una proteína de fusión de referencia que comprende la fracción de dominio de anticuerpo fusionada a una fracción IL-2 humana mutante que comprende una sustitución de aminoácido asparagina por arginina en una posición correspondiente a la posición 88 (N88R) de la secuencia de aminoácidos de proteína IL-2 humana madura establecida en la secuencia ID NO:3.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 2, en donde dicha selectividad es de entre 0, 1% y 30% de la selectividad de dicha proteína de fusión de referencia.

4. Proteína de fusión según la reivindicación 2, en donde dicha selectividad es de entre 1% y 20 % de la selectividad de dicha proteína de fusión de referencia.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 2, en donde dicha selectividad es de entre 2% y 20 % de la selectividad de dicha proteína de fusión de referencia.

6. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde las células, que expresan el receptor IL-2Raº y, se seleccionan del grupo que consiste en CTLL-2, Kit 225 y linfocitos T maduros.

7. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde las células, que expresan el receptor IL-2R y, se seleccionan del grupo que consiste en células TF-1º y células NK.

8. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde se muta más de una posición de aminoácidos en la fracción IL-2.

9. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde se muta dicho dominio de anticuerpo.

10. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 9, en donde el dominio de anticuerpo se selecciona del grupo de anticuerpos que consiste en KS-1/4, dI-KS, dI-KS (y4h) (FN>AQ) , huKS, huKS (N a Q) , dI-NHS76 (y2h) , dI-NHS (y4h) dI-NHS76 (y2h) (FN>AQ) , dI-NHS76 (y4h) (FN>AQ) , y 14.18.

11. Proteína de fusión anticuerpo-IL2 según la reivindicación 10 seleccionada del grupo que consiste en

KS-ala-IL2 (D20T)

KS (y4h) (FN>AQ) -ala-IL2 (D20T)

NHS76 (y2h) -ala-IL2 (D20T)

NHS76 (y2h) (FN>AQ) -ala-IL2 (D20T)

NHS76 (y2) -ala-IL2 (D20T) .

12. Utilización de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de tumores.

13. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su utilización en el tratamiento de tumores.