Un ácido nucleico aislado que comprende o es complementario a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa,

en el que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 14 y la SEC ID Nº : 20.

Genes de desaturasa y uso de los mismos

Campo técnico

La presente invención se refiere a la identificación y aislamiento de genes que codifican enzimas (es decir, L5desaturasa de Saprolegnia diclina y L6-desaturasa de Saprolegnia diclina) implicadas en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados y a usos de los mismos. En particular, la L5-desaturasa cataliza la conversión de, por ejemplo, ácido dihomo-y-linolénico (DGLA) en ácido araquidónico (AA) y de ácido (n-3) -eicosatetraenoico (20:4n-3) en ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) . La delta-6 desaturasa cataliza la conversión de, por ejemplo, ácido alinolénico (ALA) en ácido estearidónico (STA) . Los productos convertidos pueden utilizarse entonces como sustratos en la producción de otros ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) . El producto u otros ácidos grasos poliinsaturados pueden añadirse a composiciones farmacéuticas, composiciones nutricionales, piensos animales, así como otros productos tales como cosméticos.

Información antecedente

Las desaturasas son críticas en la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga que tienen muchas funciones importantes. Por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) son componentes importantes de la membrana plasmática de una célula, donde se encuentran en forma de fosfolípidos. También sirven como precursores para prostaciclinas, eicosanoides, leucotrienos y prostaglandinas de mamíferos. Además, los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado del cerebro del lactante en desarrollo, así como para la formación y reparación de tejidos. En vista de la significación biológica de los PUFA, se han realizado intentos para producirlos, así como intermedios que conducen a su producción, de una forma eficaz.

Varias enzimas están implicadas en la biosíntesis de PUFA además de la L5-desaturasa y de la L6-desaturasa. Por ejemplo, la elongasa (elo) cataliza la conversión de ácido y-linolénico (GLA) en ácido dihomo-y-linolénico (DGLA) y de ácido estearidónico (18:4n-3) en ácido (n-3) -eicosatetraenoico (20:4n-3) . El ácido linolénico (LA, 18:2-L9, 12 o 18:2n-6) se produce a partir del ácido oleico (18:1-L9) por una L12-desaturasa. El GLA (18:3-L6, 9, 12) se produce a partir de ácido linoleico mediante una L6-desaturasa.

Debe señalarse que los animales no pueden desaturar más allá de la posición L9 y, por lo tanto, no pueden convertir el ácido oleico en ácido linoleico. Asimismo, el ácido a-linolénico (ALA, 18:3-L9, 12, 15) no puede sintetizarse por mamíferos. Sin embargo, el ácido a-linolénico puede convertirse en ácido estearidónico (STA, 18:4-LA6, 9, 12, 15) por una L6-desaturasa (véase la publicación PCT WO 96/13591 y The Faseb Journal, Abstracts, Parte I, Resumen 3093, página A532 (Experimental Biology 98, San Francisco, CA, 18-22 abril 1998) ; véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.552.306) , seguido de alargamiento a ácido (n-3) -eicosatetraenoico (20:4-L8, 11, 14, 17) en mamíferos y algas. Este ácido graso poliinsaturado (es decir, 20:4-L8, 11, 14, 17) puede convertirse entonces en ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5-L5, 8, 11, 14, 17) por una L5-desaturasa, tal como la de la presente invención. Otros eucariotas, incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en el carbono 12 (véase la publicación PCT WO 94/11516 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.443.974) y en el carbono 15 (véase la publicación PCT WO 93/11245) . Los ácidos grasos poliinsaturados principales de animales se obtienen por lo tanto de la dieta y/o de la desaturación y alargamiento de ácido linoleico y ácido a-linolénico. En vista de estas dificultades, es de un interés significativo aislar genes implicados en la síntesis de PUFA a partir de especies que producen de forma natural estos ácidos grasos, y expresar estos genes en un sistema microbiano, vegetal o animal que pueda alterarse para proporcionar la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA.

Uno de los PUFA de cadena larga más importante señalado anteriormente es el ácido araquidónico (AA) . El AA se encuentra en hongos filamentosos y también puede purificarse a partir de tejidos de mamífero incluyendo el hígado y las glándulas adrenales. Como se ha señalado anteriormente, la producción de AA a partir de ácido dihomo-ylinolénico está catalizada por una L5-desaturasa. El EPA es otro PUFA de cadena larga importante. El EPA se encuentra en hongos y también en aceites marinos. Como se ha señalado anteriormente, el EPA se produce a partir de ácido (n-3) -eicosatetraenoico y está catalizado por una L5-desaturasa. En vista de la discusión anterior, existe una necesidad definitiva de enzimas L5-desaturasa y L6-desaturasa, los genes respectivos que codifican estas enzimas, así como métodos recombinantes de producción de estas enzimas. Además, existe la necesidad de aceites que contengan niveles de PUFA más allá de los presentes de forma natural, así como los enriquecidos en nuevos PUFA. Dichos aceites sólo pueden generarse por aislamiento y expresión de los genes de L5-desaturasa y L6-desaturasa.

Sumario de la invención

La presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada o fragmento que comprende o es complementario a al menos el 90% de una secuencia de nucleótidos que comprende la SEC ID Nº : 13 (Figura 2) o la SEC ID Nº : 19 (Figura 4) . En particular, la secuencia de nucleótidos aislada puede estar representada por la SEC ID Nº : 13 o la SEC ID Nº : 19. Estas secuencias pueden codificar una desaturasa funcionalmente activa que utilice un ácido graso poliinsaturado como sustrato.

Además, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa y que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEC ID Nº : 20.

Las secuencias de nucleótidos pueden proceder, por ejemplo, de un hongo tal como Saprolegnia diclina (SEC ID Nº : 13 y SEC ID Nº :19) .

La presente invención también incluye proteínas o polipéptidos purificados codificados por las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente.

Además, la presente invención incluye un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 5 o carbono 6, y que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de las proteínas purificadas de la SEC ID Nº : 14 o la SEC ID Nº : 20.

Además, la presente invención también incluye un método de producción de una desaturasa (es decir, L5 o L6) . Este método comprende las etapas de: a) aislar la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº : 19 y la SEC ID Nº : 13; b) construir un vector que comprende: i) la secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a ii) una secuencia reguladora; y c) introducir el vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de la L5-desaturasa o L6-desaturasa, según sea apropiado. La célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una célula eucariota o una célula procariota. En particular, la célula procariota puede ser, por ejemplo, E. coli, Cyanobacteria o B. subtilis. La célula eucariota puede ser, por ejemplo, una célula de mamífero no humano, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica (por ejemplo, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida spp., Lipomyces starkey, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Trichoderma spp. o Pichia Spp.) .

Además, la presente invención también incluye un vector que comprende: a) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 13 y la SEC ID Nº : 19 unida operativamente a b) una secuencia reguladora. La invención también incluye una célula hospedadora no humana que comprende este vector. La célula hospedadora no humana puede ser, por ejemplo, una célula eucariota o una célula procariota. Las células eucariotas y células procariotas adecuadas son como se han definido anteriormente.

Además, la presente invención también incluye una célula vegetal, planta o tejido vegetal que comprende el vector anterior, en la que la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de al menos un ácido graso poliinsaturado por la célula vegetal, planta o tejido vegetal. El ácido graso poliinsaturado puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que comprende o es complementario a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 14 y la SEC ID Nº : 20.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o es complementaria a al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 13 y la SEC ID Nº : 19.

3. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 13 y la SEC ID Nº : 19.

4. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 2 ó 3, en la que dicha secuencia codifica una desaturasa funcionalmente activa que utiliza un ácido graso poliinsaturado como sustrato.

5. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 4, en la que la SEC ID Nº : 13 y la SEC ID Nº : 19 proceden de

Saprolegnia diclina.

6. Un polipéptido purificado codificado por dicha secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, 2 ó 3.

7. Un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 5 y que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEC ID Nº : 20.

8. Un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 6 y que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEC ID Nº : 14.

9. Un método de producción de una desaturasa, que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 13 y la SEC ID Nº : 19; b) construir un vector que comprenda: i) dicha secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a ii) una secuencia reguladora; c) introducir dicho vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de dicha desaturasa.

10. Un vector que comprende: a) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº : 13 y la SEC ID Nº : 19, unida operativamente a b) una secuencia reguladora.

11. Una célula hospedadora no humana que comprende dicho vector de la reivindicación 10.

12. Una célula de mamífero no humano que comprende dicho vector de la reivindicación 10, en la que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de niveles alterados de AA, EPA, GLA o STA cuando dicha célula se cultiva en un medio de cultivo que comprende al menos un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en LA, ALA, DGLA y ESP.

13. Una célula vegetal, planta o tejido vegetal que comprende dicho vector de la reivindicación 10, en la que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado por dicha célula vegetal, planta o tejido vegetal.

14. La célula vegetal, planta o tejido vegetal de la reivindicación 13, en la que dicho ácido graso poliinsaturado se selecciona del grupo que consiste en AA, EPA, GLA y STA.

15. Una planta transgénica que comprende dicho vector de la reivindicación 10, en la que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado en semillas de dicha planta transgénica.

16. Un método para producir un ácido graso poliinsaturado, que comprende las etapas de;

a) aislar una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEC ID Nº : 19; b) construir un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos aislada; c) introducir dicho vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de enzima L5-desaturasa; y d) exponer dicha enzima L5-desaturasa expresada a un ácido graso poliinsaturado sustrato para convertir dicho sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho ácido graso poliinsaturado sustrato es DGLA o 20:4n-3 y dicho ácido graso poliinsaturado producto es AA o EPA, respectivamente.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende además la etapa de exponer dicho ácido graso poliinsaturado producto a una elongasa para convertir dicho ácido graso poliinsaturado producto en otro ácido graso poliinsaturado.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho ácido graso poliinsaturado producto es AA o EPA y dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido adrénico o ácido (n-3) -docosapentaenoico, respectivamente.

20. El método de la reivindicación 18, que comprende además la etapa de exponer dicho otro ácido graso poliinsaturado a una desaturasa adicional para convertir dicho otro ácido graso poliinsaturado en un ácido graso poliinsaturado final.

21. El método de la reivindicación 20, en el que dicho ácido graso poliinsaturado final es ácido (n-6) docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico (DHA) .

22. Un método para producir un ácido graso poliinsaturado, que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEC ID Nº : 13; b) construir un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos aislada; c) introducir dicho vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de enzima L6-desaturasa; y d) exponer dicha enzima L6-desaturasa expresada a un ácido graso poliinsaturado sustrato para convertir dicho sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho ácido graso poliinsaturado sustrato es LA o ALA y dicho ácido graso poliinsaturado producto es GLA o STA, respectivamente.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende además la etapa de exponer dicho ácido graso poliinsaturado producto a una elongasa para convertir dicho ácido graso poliinsaturado producto en otro ácido graso poliinsaturado.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicho ácido graso poliinsaturado producto es GLA o STA y dicho otro ácido graso poliinsaturado es DGLA o ETA, respectivamente.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además la etapa de exponer dicho otro ácido graso poliinsaturado a una desaturasa adicional para convertir dicho otro ácido graso poliinsaturado en un ácido graso poliinsaturado final.

27. El método de la reivindicación 26, en el que dicho ácido graso poliinsaturado final es AA o EPA.

Figura 1

Ruta biosintética de ácido graso

Figura 2

Secuencia génica de delta 6-desaturasa de Saprolegnia diclina (ATCC 56851)

Figura 3

Secuencia de aminoácidos de delta 6-desaturasa de Saprolegnia diclina (ATCC 56851)

Figura 4

Secuencia génica de delta 5- desaturasa de Saprolegnia diclina (ATCC 56851)

Figura 5

Secuencia de aminoácidos de delta 5-desaturasa de Saprolegnia diclina (ATCC 56851)

Figura 6 (comparativa)

Secuencia génica de delta 5-desaturasa de Thraustochytrium aureum (KIGC 34304)

Figura 7 (comparativa)

Secuencia de aminoácidos de delta 5-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304)

Figura 15 (comparativa)