Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa,

donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 42.

Genes de desaturasa, enzimas codificadas por estos genes y utilización de los mismos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la identificación y el aislamiento de genes novedosos que codifican enzimas implicadas en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) . La invención también está dirigida a enzimas desaturasas novedosas codificadas por estos genes y a métodos de utilización de los genes y/o las enzimas codificadas por los genes. En particular, la invención está dirigida a genes derivados del hongo Saprolegnia diclina (ATCC 56851) que codifican una w3 desaturasa novedosa (también referida en la presente memoria como L17 desaturasa) y a una L12 desaturasa novedosa. Estas enzimas catalizan la introducción de un doble enlace carbonocarbono entre una posición concreta dentro de un ácido graso sustrato. Por ejemplo, la w3 desaturasa novedosa descrita en la presente memoria cataliza la conversión de ácido araquidónico (20:4n-6) en ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) (así como otras reacciones de desaturación que implican otros sustratos) . Del mismo modo, la L12 desaturasa novedosa descrita en la presente memoria cataliza la conversión de ácido oleico (18:1n-9) en ácido linoleico (18:2n-6) . Los PUFA formados de este modo se pueden añadir a composiciones farmacéuticas, composiciones nutricionales, alimentos para animales, u otros productos.

ANTECEDENTES

Las desaturasas son una clase de enzimas críticas en la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) juegan muchos papeles en el funcionamiento apropiado de todas las formas de vida. Por ejemplo, los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula, donde se encuentran en forma de fosfolípidos. Los PUFA también son precursores de las prostaciclinas, eicosanoides, leucotrienos y prostaglandinas de mamíferos. Adicionalmente, los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado del cerebro del lactante, así como para la formación y reparación de tejidos en mamíferos maduros. A la vista de la transcendencia biológica de los PUFA, se están realizando intentos para producirlos de una manera eficaz.

Numerosas enzimas, muy notablemente desaturasas y elongasas, están implicadas en la biosíntesis de los PUFA (véase la Figura 1) . Las elongasas catalizan la adición de una unidad de 2 carbonos a un ácido graso sustrato. De este modo, por ejemplo, una elongasa (genéricamente denominada "elo" en la Figura 1) cataliza la conversión de ácido y-linolénico (18:3n-6) en ácido dihomo-y-linolénico (20:3n-6) , así como la conversión de ácido estearidonico (18:4n-3) en ácido eicosatetraenoico (20:4n-3) , etc.

Las desaturasas catalizan la introducción de insaturaciones (esto es, dobles enlaces) entre átomos de carbono en la cadena alquílica del ácido graso del sustrato. De este modo, por ejemplo, el ácido linoleico (18:2n-6) es producido a partir de ácido oleico (18:1n-9) por la acción de una L12 desaturasa. De un modo similar, el ácido y-linolénico (18:3n6) es producido a partir de ácido linoleico por la acción de una L6 desaturasa.

En toda la presente solicitud, los PUFA serán identificados inequívocamente utilizando el sistema de nomenclatura "omega" aprobado por los fisiólogos y bioquímicos, en oposición al sistema "delta" o I.U.P.A.C. aprobado normalmente por los químicos. En el sistema "omega", un PUFA es identificado por una designación numérica del número de carbonos de la cadena. Esta está seguida de dos puntos y después otra designación numérica del número de insaturaciones de la molécula. Esto está seguido después por la designación "n-x, " donde x es el número de carbonos desde el extremo metílico de la molécula donde está localizada la primera insaturación. Cada insaturación de la subsecuencia (donde hay más de un doble enlace) está localizada 3 átomos de carbono adicionales hacia el extremo carboxilo de la molécula. De este modo, los PUFA descritos en la presente memoria pueden ser descritos por ser PUFA "interrumpidos por metileno". Cuando se requiere alguna otra designación, se indicarán las desviaciones del sistema "omega".

Cuando sea apropiado, la acción de las enzimas desaturasas descritas en la presente memoria también será identificada utilizando el sistema "omega". De este modo, una "omega-3" desaturasa cataliza la introducción de un doble enlace entre los dos carbonos en las posiciones 3 y 4 desde el extremo metilo del sustrato. No obstante, en muchos casos, es más conveniente indicar la actividad de una desaturasa contando desde el extremo carboxilo del sustrato. De este modo, como se muestra en la Figura 1, una L9 desaturasa cataliza la introducción de un doble enlace entre los dos carbonos de las posiciones 9 y 10 desde el extremo carboxilo del sustrato. En resumen, cuando se utiliza el término "omega", se está designando la posición en el sustrato con respecto al extremo metilo; cuando se utiliza el término "delta", se está designando la posición en el sustrato con respecto al extremo carboxilo.

Se debe observar que los mamíferos no pueden desaturar ácidos graso sustrato más allá de la posición L9 (esto es, una distancia de 9 átomos de carbono más allá del extremo carboxilo) . De este modo, por ejemplo, los mamíferos no pueden convertir ácido oleico (18:1n-9) en ácido linoleico (18:2n-6) ; el ácido linoleico contiene una insaturación en la

posición L12. Del mismo modo, el ácido a-linolénico (18:3n-3) (que tiene insaturaciones en L12 y L15) no puede ser sintetizado por los mamíferos. Sin embargo, por ejemplo, los mamíferos pueden convertir ácido a-linolénico en ácido estearidonico (18:4n-3) por la acción de una L6 desaturasa. (Véase la Figura 1. Véase también la publicación PCT WO 96/13591; El FASEB Journal, Resúmenes, Parte I, Resumen 3093, página A532 (Experimental Biology 98, San Francisco, CA, 18-22 Abril, 1998) ; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.552.306) .

Refiriéndose todavía a la Figura 1, en mamíferos, hongos, y algas, el ácido estearidónico formado de ese modo es convertido en ácido eicosatetraenoico (20:4n-3) mediante la acción de una elongasa. Este PUFA se puede convertir después en ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) por medio de una L5 desaturasa. El ácido eicosapentaenoico se puede convertir después a su vez en ácido w3-docosapentaenoico (22:5n-3) por medio de una elongasa.

Otros eucariotas, incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan ácidos grasos sustrato en el carbono L12 (véase la publicación PCT WO 94/11516 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.443.974) y en el carbono delta-15 (véase la publicación PCT WO 93/11245) . Los principales ácidos grasos poliinsaturados de los animales derivan por lo tanto de la dieta y/o de la desaturación y elongación del ácido linoleico o el ácido alinolénico. A la vista de estas dificultades, todavía permanece la necesidad de aislar los genes implicados en la síntesis de PUFA. Idealmente, estos genes se originarían a partir de especies que naturalmente producen ácidos grasos que no son producidos naturalmente en los mamíferos. Estos genes podrían ser expresados después en un sistema microbiano, vegetal, o animal, que sería alterado de ese modo para producir cantidades comerciales de uno o más PUFA. Así, existe una necesidad definida de enzimas L12- y L17 desaturasas, los respectivos genes que codifican estas enzimas; así como métodos recombinantes de producción de estas enzimas. Adicionalmente, existe la necesidad de aceites que contengan niveles de PUFA además de los presentes naturalmente. El acceso a tales enzimas L12-y L17 desaturasas permite la producción de grandes cantidades de PUFA que no pueden ser sintetizados de novo en mamíferos. Estos PUFA pueden ser utilizados como agentes farmacéuticos y/o suplementos nutricionales.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Una realización de la presente invención abarca una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad omega-3 desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

Una segunda realización abarca una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipeptido que tiene actividad delta-12 desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con una secuencia... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad omega-3 desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 80% de la secuencia del aminoacido SEQ ID NO: 26.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende o complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-12 desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos 90% de la secuencia del aminoacido SEQ ID NO: 42.

3. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad omega-3 desaturasa, dicha secuencia de nucleótidos comprende o complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 80% de la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 25.

4. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-12 desaturasa, dicha secuencia de nucleótidos comprende o complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% de la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 41.

5. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 3, donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 25.

6. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 4, donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 41.

7. La secuencia de nucleótidos aislada de cualquiera de las reivindicacione.

3. 6, donde dicha secuencia codifica una desaturasa funcionalmente activa que utiliza un ácido graso poliinsaturado como sustrato.

8. La secuencia de nucleótidos aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, donde dicha secuencia deriva de

Saprolegnia diclina.

9. Un polipéptido purificado codificado por dicha secuencia de nucleótidos aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4

10. Un polipéptido purificado que desatura un ácido graso poliinsaturado sustrato que tiene 20 atomos de carbono en un carbono omega-3 de dicho sustrato y tiene una identidad de aminoácidos de al menos 30% con una secuencia de aminoácidos que comprende el SEQ ID NO: 26.

11. Un polipéptido purificado que desatura un ácido graso poliinsaturado sustrato en un carbono delta-12 de dicho sustrato y tiene una identidad de aminoácidos de al menos 90% con el SEQ ID NO: 42.

12. El polipéptido purificado de la reivindicación 11, donde dicho polipéptido desatura un ácido graso sustrato que tiene 18 átomos de carbono.

13. Un método de producción de una omega-3 desaturasa o una delta-12 desaturasa que comprende las etapas de:

(a) aislar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos o complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 80% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 25 o tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de nucleótido que consiste en SEQ ID NO: 41;

(b) construir un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos aislada de la etapa (a) ; y

(c) introducir dicho vector de la etapa (b) en una célula hospedadora durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para la expresión de una desaturasa codificada por dicha secuencia de nucleótidos aislada de la etapa (a) .

14. Un vector que comprende: 1) una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad omega-3 desaturasa, correspondiente dicha secuencia de nucleótidos o complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 80% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25, conectada operablemente a b) una secuencia reguladora.

15. Un vector que comprende: 1) una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-12 desaturasa, correspondiente dicha secuencia de nucleótidos o complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% con una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 41, conectada operablemente a b) una secuencia reguladora.

16. Una célula hospedadora que comprende dicho vector de la reivindicación 14 o reivindicación 15.

17. La célula hospedadora de la reivindicación 16 donde dicha célula hospedadora es una célula eucariótica seleccionada del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal y una célula fúngica.

18. La célula hospedadora de la reivindicación 17, donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos aislada de dicho vector da como resultado dicha célula hospedadora productora de un ácido graso poliinsaturado que no es producido en el tipo salvaje de dicha célula hospedadora.

19. Una célula vegetal, planta, o tejido vegetal que comprende dicho vector de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado por dicha célula vegetal, planta o tejido vegetal.

20. La célula vegetal, planta, o tejido vegetal de la reivindicación 19, donde dicho vector induce la producción de un ácido graso poliinsaturado seleccionado del grupo que consiste en ácido linoleico, ácido eicosatetraenoico y ácido eicosapentaenoico.

21. Una planta transgénica que comprende dicho vector de la reivindicación 14 o la reivindicación 15 , donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado en las semillas de dicha planta transgénica.

22. Un método para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de:

(a) aislar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos o complementaria a una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 80% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25 o tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de nucleótido que consiste en SEQ ID NO: 41;

(b) construir un vector que comprenda dicha secuencia de nucleótidos aislada de la etapa (a) ;

(c) transformar el vector de la etapa (b) en una célula hospedadora durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para la expresión de una desaturasa codificada por dicha secuencia de nucleótidos aislada de la etapa (a) ; y (d) donde la desaturasa expresada consiste en una omega-3 desaturasa, exponiendo dicha desaturasa expresada a un ácido graso sustrato, que es ácido dihomo-gamma-linolénico o ácido araquidónico de manera que el sustrato es convertido por dicha desaturasa en el ácido graso poliinsaturado producto es acido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico, respectivamente o donde la desaturasa expresada consiste en una delta-12 desaturasa, exponiendo dicha desaturada expresada a un ácido graso sustrato, que es ácido oleico de manera que se convierte el sustrato por dicha desaturasa en el ácido poliinsaturado producto linoleico.

23. El método de la reivindicación 22, que comprende además de la etapa (d) , la etapa de:

(e) exponer dicho ácido graso poliinsaturado producto de la etapa (d) a una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una desaturasa y una elongasa, por medio de lo cual el ácido graso poliinsaturado producto de la etapa (d) es convertido catalíticamente en otro ácido graso poliinsaturado producto.

24. El método de la reivindicación 23, donde dicho ácido graso poliinsaturado producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico y dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido eicosapentaenoico o ácido omega-3docosapentaenoico, respectivamente, cuando dicha desaturasa expresada de la etapa (d) es una omega-3 desaturasa, o donde dicho ácido graso poliinsaturado producto es ácido linoleico y dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido gamma-linolénico, cuando dicha desaturasa expresada de la etapa (d) es una delta-12 desaturasa.

25. El método de la reivindicación 24 que comprende adicionalmente la etapa de exponer dicho otro ácido graso poliinsaturado a una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una desaturasa y una elongasa con el fin de convertir dicho otro ácido graso poliinsaturado en un ácido graso poliinsaturado final.

26. El método de la reivindicación 25 donde dicho ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste en ácido omega-3-docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, cuando dicha desaturasa expresada de la etapa (d) es una omega-3 desaturasa, o donde dicho ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste en ácido dihomo-gamma- linolénico, ácido araquidónico, ácido adrénico, ácido omega-6-docosapentaenoico, ácido eicosatetraenoico, ácido

estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido omega-3-docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, cuando dicha desaturasa expresada de la etapa (d) es una delta-12 desaturasa.

27. Un método de producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende exponer un ácido graso sustrato a un

polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de al menos 80% con una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 26, por medio de lo cual dicho ácido graso sustrato es convertido catalíticamente en dicho ácido graso poliinsaturado, donde el ácido graso sustrato es ácido dihomo-gamma-linolénico o ácido araquidónico y dicho ácido graso poliinsaturado producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico, respectivamente, cuando dicho polipéptido es una omega-3 desaturasa.

28. Un método de producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende exponer un ácido graso sustrato a un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de al menos 90% con una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 42, por medio de lo cual dicho ácido graso sustrato es convertido catalíticamente en dicho ácido graso poliinsaturado, donde dicho ácido graso sustrato es ácido oleico y dicho ácido graso poliinsaturado es ácido linoleico, cuando dicho polipéptido es una delta-12 desaturasa.