GEN DE STREPTOMYCES AVEMITILIS QUE DIRIGE LA PROPORCIÓN DE AVERMECTINAS B2:B1.

Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis,

la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1), o una variante de la misma que incluye uno o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, de modo que las células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que se ha inactivado el alelo de aveC de tipo silvestre y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase 2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase 2:1 es de 0,2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en: (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D

Gen de Streptomyces avermitilis que dirige la proporción de avermectinas B2:B1

1. Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para la producción eficaz de avermectinas tales como “doramectina”, que son principalmente útiles en el campo de la salud animal. Más particularmente, la presente invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico AveC que puede usarse para modular la proporción de avermectinas de clase 2:1 producidas por cultivos de fermentación de Streptomyces avermitilis. La presente invención se refiere además a vectores, células huésped transformadas y nuevas cepas mutantes de S. avermitilis en las que el gen aveC se ha mutado para modular la proporción de avermectinas de clase 2:1 producidas.

2. Antecedentes de la invención 2.1. Avermectinas Las especies de Streptomyces producen una amplia diversidad de metabolitos secundarios, incluyendo las avermectinas, que comprenden una serie de ocho lactonas macrocíclicas de dieciséis miembros relacionadas que tienen potente actividad antihelmíntica e insecticida. Los ocho compuestos diferentes pero estrechamente relacionados se denominan A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a y B2b. La serie “a” de compuestos se refiere a la avermectina natural en la que sustituyente en la posición C25 es (S) -sec-butilo, y la serie “b” se refiere a los compuestos en los que el sustituyente en la posición C25 es isopropilo. Las designaciones “A” y “B” se refieren a avermectinas en las que el sustituyente la posición C5 es metoxi e hidroxi, respectivamente. El número “1” se refiere a avermectinas en las que está presente un doble enlace en la posición C22, 23, y el número “2” se refiere a avermectinas que tienen un hidrógeno en la posición C22 y un hidroxi en la posición C23. Entre las avermectinas relacionadas, el tipo B1 de avermectina, tal como doramectina, se reconoce que tiene la actividad antiparasitaria y pesticida más eficaz y, por lo tanto, es la avermectina más deseable comercialmente.

Las avermectinas y su producción por fermentación aerobia de cepas S. avermitilis se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.310.519 y 4.429.042. Se cree que la biosíntesis de avermectinas naturales se inicia endógenamente a partir de los análogos de tioéster de CoA de ácido isobutírico y ácido S- (+) -2-metil butírico.

Una combinación tanto de mejora de cepa por mutagénesis aleatoria como del uso de ácidos grasos suministrados exógenamente ha conducido a la producción eficaz de análogos de avermectina. Los mutantes de S. avermitilis que son deficientes en 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada (mutantes deficientes en bkd) sólo pueden producir avermectinas cuando las fermentaciones se complementan con ácidos grasos. La exploración y aislamiento de mutantes deficientes en actividad de deshidrogenasa de cadena ramificada (por ejemplo, S. avermitilis, ATCC 53567) se describen en la Patente Europea (EP) 276103. La fermentación de dichos mutantes en presencia de ácidos grasos suministrados exógenamente da como resultado la producción de sólo las cuatro avermectinas correspondientes al ácido graso empleado. Por lo tanto, la complementación de las fermentaciones de S. avermitilis (ATCC 53567) con ácido S- (+) -2-metilbutírico da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1a, A2a, B1a y B2a; la complementación de las fermentaciones con ácido isobutírico da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1b, A2b, B1b y B2b; y la complementación de las fermentaciones con ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las cuatro nuevas ciclopentilavermectinas A1, A2, B1 y B2.

Si se complementan con otros ácidos grasos, se producen nuevas avermectinas. Por exploración de más de 800 precursores potenciales, se han identificado más de 60 otras nuevas avermectinas. (Véase, por ejemplo, Dutton y col., 1991, J. Antibiot. 44: 357-365; y Banks y col., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26) . Además, los mutantes de S. avermitilis deficientes en actividad 5-O-metiltransferasa producen esencialmente sólo las avermectinas de análogos B. Por consiguiente, los mutantes de S. avermitilis que carecen de actividad tanto de 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada como de 5-O-metiltransferasa producen sólo las avermectinas B correspondientes al ácido graso empleado para complementar la fermentación. Por lo tanto, la complementación de dichos dobles mutantes con ácido S- (+) -2-metilbutírico da como resultado la producción de solamente las avermectinas naturales B1a y B2a, mientras que la complementación con ácido isobutírico o ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las avermectinas naturales B1b y B2b o las nuevas ciclopentil avermectinas B1 y B2, respectivamente. La complementación de la cepa doble mutante con ácido ciclohexano carboxílico es un procedimiento preferido para producir la nueva avermectina comercialmente importante, ciclohexilavermecinta B1 (doramectina) . El aislamiento y las características de dichos dobles mutantes, por ejemplo, S. avermitilis (ATCC 53692) , se describen en el documento EP 276103.

2.2. Genes implicados en la biosíntesis de avermectina En muchos casos, los genes implicados en la producción de metabolitos secundarios y los genes que codifican un antibiótico particular se encuentran agrupados en el cromosoma. Tal es el caso con el grupo de genes de policétido sintasa de Streptomyces (PKS) (véase Hopwood y Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 37-66) . Por lo tanto, una estrategia para clonar genes en una ruta biosintética ha sido aislar un gen de resistencia farmacológica y después ensayar regiones adyacentes del cromosoma para otros genes relacionados con la biosíntesis de ese antibiótico particular. Otra estrategia para clonar genes implicados en la biosíntesis de metabolitos importantes ha sido la complementación de mutantes. Por ejemplo, porciones de una genoteca de ADN de un organismo capaz de producir un metabolito particular se introducen en un mutante no productor y los transformantes se exploran para determinar la producción del metabolito. Además, la hibridación de una genoteca usando sondas derivadas de otras especies de Streptomyces se ha usado para identificar y clonar genes en rutas biosintéticas.

Los genes implicados en la biosíntesis de avermectina (genes ave) , como los genes necesarios para la biosíntesis de otros metabolitos secundarios de Streptomyces (por ejemplo, PKS) , se encuentran agrupados en el cromosoma. Varios genes ave se han clonado con éxito usando vectores para complementar los mutantes de S. avermitilis bloqueados en la biosíntesis de avermectina. La clonación de dichos genes se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.252.474. Además, Ikeda y col., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534 describe la localización de una región cromosómica que implica la etapa de deshidratación de C22, 23 (aveC) en un fragmento BamHI de 4, 82 kb de S. avermitilis, así como mutaciones en el gen aveC que dan como resultado la producción de un productor de B2a de un solo componente. Puesto que la ivermectina, un potente compuesto antihelmíntico, puede producirse químicamente a partir de la avermectina B2a, dicho productor de un solo componente de avermectina B2a se considera particularmente útil para la producción comercial de ivermectina.

La Patente de Estados Unidos Nº 6.248.579 para Stutzman-Engwall y col., expedida el 19 de junio de 2001, describe ciertas mutaciones en el gen aveC de Streptomyces avermitilis que conducen a una reducción en la proporción de ciclohexil B2:ciclohexil B1 hasta aproximadamente 0, 75:1.

La Publicación PCT WO 01/12821 por Pfizer Products Inc., publicada el 22 de febrero de 2001 describe ciertas mutaciones adicionales en el gen aveC de Streptomyces avermitilis que conducen a reducciones adicionales en la proporción de ciclohexil B2:ciclohexil B1 hasta 0, 40:1.

La identificación de mutaciones o combinaciones de mutaciones adicionales en el gen aveC que minimicen adicionalmente la complejidad de la producción de avermectina, tales como, por ejemplo, mutaciones que disminuyan adicionalmente la proporción de avermectinas B2:B1, debería simplificar la producción y purificación de avermectinas comercialmente importantes.

3. Sumario de la invención La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces... [Seguir leyendo]

1. Una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que de otro modo es la misma que el alelo de aveC de Streptomyces avermitilis, la secuencia codificante de producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID Nº: 1) , o una variante de la misma que incluye uno o más cambios silentes en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético, pero comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos además mutaciones que codifican una combinación de sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, de modo que las células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 en las que se ha inactivado el alelo de aveC de tipo silvestre y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada son capaces de producir una proporción de avermectinas de clase 2:1 que está reducida en comparación con la proporción producida por células de la cepa de S. avermitilis ATCC 53692 que en su lugar expresan solamente el alelo de aveC de tipo silvestre, en la que cuando las avermectinas de clase 2:1 son avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1, la proporción de avermectinas de clase 2:1 es de 0, 2:1 o menos, y en la que las combinaciones de sustituciones aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, y en la que la combinación de sustituciones de aminoácidos comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.

2. Un vector recombinante que comprende una molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que comprende el vector recombinante de la reivindicación 2, con la condición de que dicha célula huésped no sea un organismo humano.

4. La célula huésped de la reivindicación 3, que es una célula de Streptomyces.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, que es una célula de Streptomyces avermitilis.

6. Un procedimiento para generar una cepa de Streptomyces avermitilis, que comprende (i) mutar el alelo de aveC en una célula de una cepa de S. avermitilis, dando dicha mutación como resultado una combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, o (ii) introducir en una célula de una cepa de S. avermitilis un alelo de aveC mutado o variante degenerada del mismo que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos, en el que las células que comprenden el alelo de aveC mutado o una variante degenerada son capaces de producir avermectinas ciclohexil B2:ciclohexil B1 en una proporción de 0, 2:1 o menos, y en el que las combinaciones de sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones tanto en D48 como en G179, en el que la combinación de sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en:

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;

(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.

7. Una célula de una especie de Streptomyces que comprende un alelo de aveC de S. avermitilis mutado como se define en la reivindicación 1, o una variante degenerada del mismo, que codifica un producto génico AveC que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;

(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A; (bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; y (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.

8. La célula de la reivindicación 7, que es una célula de Streptomyces avermitilis.

9. Un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar una cepa de las células de Streptomyces avermitilis de la reivindicación 8 en medios de cultivo en condiciones que permitan o induzcan la producción de avermectinas a partir de las mismas, y recuperar dichas avermectinas a partir del cultivo.