Polipéptido aislado que incluye un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o un fragmentofuncional de éste,

que tiene al menos una sustitución de Pro por Gly y muestra una estabilidad aumentada encomparación con un dominio CH3 no sustituido, comprendiendo dicha o dichas sustituciones de Pro por Gly un residuoPro38 de CH3, comprendiendo dicho polipéptido aislado además una tasa de plegado aumentada en comparación conun dominio CH3 no sustituido, y comprendiendo opcionalmente dicha tasa de plegado aumentada un aumento en unfactor de 3 o más en comparación con un dominio CH3 de tipo salvaje.

Dominios de región constante de inmunoglobulina con estabilidad mejorada

En general, la presente invención se refiere a medicamentos para el tratamiento de enfermedades y, más específicamente, a productos farmacéuticos polipeptídicos de estabilidad mejorada.

Con la llegada de la tecnología de ADN recombinante, los productos terapéuticos basados en proteínas se han ido haciendo cada vez más habituales en el repertorio de fármacos de que disponen los facultativos para tratar una amplia gama de enfermedades, desde cáncer hasta enfermedades autoinmunes. Junto a los avances científicos y técnicos que han tenido lugar en la producción de proteínas recombinantes, otra razón del éxito de los productos terapéuticos basados en proteínas es su alta especificidad con respecto a las moléculas diana. La capacidad para emplear moléculas biológicas como productos farmacéuticos en el tratamiento de enfermedades ha hecho avanzar de forma significativa la atención médica y la calidad de vida durante el último cuarto de siglo. En el año 2005 había en el mercado más de ciento cincuenta productos farmacéuticos basados en proteínas aprobados, y se espera que esta cantidad aumente en los próximos años.

Actualmente se pueden producir algunas proteínas que muestran diversos efectos farmacológicos in vivo en grandes cantidades para diferentes aplicaciones farmacéuticas. La estabilidad y homogeneidad de una preparación proteínica farmacéutica es un criterio particularmente ventajoso para lograr tratamientos seguros, coherentes y eficaces. La pérdida de funcionalidad del producto terapéutico dentro de una preparación disminuirá su concentración efectiva en una administración dada. Similarmente, las especies de conformación no deseada de una proteína terapéutica pueden conducir a una pérdida de eficacia y al riesgo de efectos secundarios adversos.

Las proteínas son moléculas complejas con estructuras primarias, secundarias, terciarias y en algunos casos cuaternarias definidas, que todas ellas desempeñan un papel en la impartición de funciones biológicas específicas. La complejidad estructural de productos farmacéuticos biológicos tales como proteínas hace que éstas sean susceptibles a diversos procesos que conllevan a una inestabilidad estructural y funcional y a una pérdida de seguridad. Por ejemplo, la producción recombinante de productos terapéuticos de anticuerpos requiere que cada cadena del complejo multimérico se sintetice con exactitud, plegada correctamente y autoensamblada en complejos diméricos o tetraméricos.

El tercer dominio de región constante de anticuerpos (CH3) desempeña una función estructural en la estabilidad y la asociación de cadenas pesadas de moléculas de anticuerpos. Aparte de los enlaces disulfuro que mantienen unidas las dos cadenas pesadas en la región bisagra, fuertes interacciones no covalentes entre los dos monómeros del dominio CH3 estabilizan la región constante (Fc) de las moléculas de anticuerpos. El dominio CH3 tiene un enlace disulfuro de intradominio insertado que estabiliza dos holas 1, una característica común observada en miembros de la superfamilia peptídica de las inmunoglobulinas. Sin embargo, diversos anticuerpos terapéuticos (tanto IgG1 como IgG2) presentan enlaces disulfuro reducidos hasta en un 15% de los dominios CH3. Se ha informado de que el dominio CH3 reducido es mucho menos estable que la molécula oxidada frente al calor, el pH ácido y desnaturalizantes químicos tales como clorhidrato de guanidina. Además, en el estado reducido y desplegado, cuando las cisteínas están expuestas a los disolventes, estos residuos son susceptibles de formar enlaces disulfuro intermoleculares, que conducen a agregados covalentes irreversibles. La agregación proteínica tiene una importancia particular en la producción biofarmacéutica, ya que, con frecuencia, conduce a una reducción de la bioactividad que influye en la potencia del fármaco, y también puede provocar reacciones inmunológicas o antigénicas no deseables en los pacientes.

En este contexto, Demarest, S.J. y col. (Demarest, S.J. y col., J. Mol. Biol. 335 (1) , 2 de enero de 2004, pp. 41-48) describen la optimización de las características de plegado/replegado del dominio CH3 de anticuerpos mediante la comparación de secuencias Fc de 19 especies de mamíferos diferentes, la identificación de sitios específicos para la optimización y la mutación de dichos sitios.

Sin embargo, a pesar de los avances realizados en la utilización de proteínas en los tratamientos terapéuticos y sus métodos de producción, sigue existiendo la necesidad de desarrollar productos biofarmacéuticos basados en anticuerpos con mayor homogeneidad de conformación y estabilidad mejorada. La producción de una preparación de anticuerpos terapéuticos próxima a la homogeneidad para una conformación nativa correctamente plegada que posea enlaces disulfuro adecuados aumentaría la eficacia y seguridad del producto terapéutico y reduciría los costes de producción y tratamiento. Numerosos anticuerpos terapéuticos y proteínas terapéuticas basadas en anticuerpos resultarían beneficiados con estas mejoras.

Así, existe la necesidad de disponer de preparaciones biofarmacéuticas que demuestren una mayor homogeneidad estructural y estabilidad cuando se producen bajo diversas condiciones diferentes. La presente invención satisface esta necesidad y además proporciona ventajas relacionadas.

La invención proporciona un polipéptido aislado que incluye un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina, o un fragmento funcional de éste, que presenta al menos una sustitución Pro a Gly y muestra una estabilidad aumentada, incluyendo una mayor tasa de plegado, en comparación con un dominio CH3 de tipo salvaje (WT) no sustituido, y donde la o las sustituciones de Pro a Gly comprenden un residuo Pro38 de CH3 o un dominio CH3 equivalente al mismo. La invención también proporciona complejos multiméricos de un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina, o un fragmento funcional de éste, que tiene al menos una sustitución Pro a Gly con un segundo polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina. Los complejos multiméricos pueden incluir anticuerpos, fragmentos funcionales de anticuerpos, como Fd, Fv, Fab, F (ab’) , F (ab) 2, F (ab’) 2, Fv monocatenario (scFv) , anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos o minicuerpos y otros polipéptidos de unión que tienen un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina tales como un pepticuerpo o un polipéptido de fusión de Fc. También se proporciona una población aislada de polipéptidos, incluyendo una pluralidad de polipéptidos de dominio de región CH3 de inmunoglobulina, o fragmentos funcionales de la misma. Cada polipéptido de dominio de región CH3 dentro de las poblaciones incluye al menos una sustitución Pro a Gly y muestra una mayor estabilidad, incluyendo una mayor tasa de plegado, en comparación con un dominio CH3 no sustituido, comprendiendo la o las sustituciones Pro a Gly un residuo Pro38 de CH3 o un dominio CH3 equivalente al mismo. La invención también proporciona un método para producir un polipéptido de unión multimérico y un polipéptido de unión para el tratamiento de una afección patológica caracterizada por un crecimiento celular aberrante.

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de un dominio CH3 de tipo salvaje (WT) representativo (SEQ ID Nº: 1) , correspondiente a un dominio CH3 de IgG1.

La Figura 2 muestra la alineación de secuencia de los aminoácidos de los dominios de región constante para las IgG subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (SEQ ID Nº: 2-5, respectivamente) . Debajo de la alineación se muestra una secuencia de aminoácidos consenso para el dominio de región constante de estas subclases de IgG (SEQ ID Nº: 6) . El residuo Pro38 del dominio CH3 está localizado en el residuo 257 en cada dominio de región constante de esta alineación, que corresponde al residuo 155 en la secuencia de la región Fc humana descrita más abajo (SEQ ID Nº: 13) .

La Figura 3 muestra la alineación de secuencia de los aminoácidos de los dominios de región constante para las Ig de las clases IgG (representada por IgG1) , IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM (SEQ ID Nº: 2 y 7-11, respectivamente) . Debajo de la alineación se muestra una secuencia de aminoácidos consenso para el dominio de región constante de estas clases de Ig (SEQ ID Nº: 12) . El residuo Pro38 del dominio CH3 está localizado en el residuo 381 en cada dominio de región constante de esta alineación,... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado que incluye un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o un fragmento funcional de éste, que tiene al menos una sustitución de Pro por Gly y muestra una estabilidad aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido, comprendiendo dicha o dichas sustituciones de Pro por Gly un residuo Pro38 de CH3, comprendiendo dicho polipéptido aislado además una tasa de plegado aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido, y comprendiendo opcionalmente dicha tasa de plegado aumentada un aumento en un factor de 3 o más en comparación con un dominio CH3 de tipo salvaje.

2. Péptido aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha tasa de plegado aumentada comprende un aumento en un factor de aproximadamente 6, aproximadamente 12 o aproximadamente 18 o más.

3. Inmunoglobulina aislada que incluye el polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o un fragmento funcional de éste según la reivindicación 1.

4. Polipéptido de unión aislado que incluye el polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o un fragmento funcional de éste según la reivindicación 1 fusionado con un dominio de unión diana.

5. Población aislada de polipéptidos, incluyendo dicha población una pluralidad de polipéptidos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

6. Población aislada de polipéptidos según la reivindicación 5, incluyendo dicha población una pluralidad de polipéptidos según la reivindicación 1, y comprendiendo dicha pluralidad de polipéptidos de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o fragmentos funcionales de los mismos más de aproximadamente un 92% de polipéptidos de dominio CH3 correctamente plegados y opcionalmente más de aproximadamente un 94%, 96%, 98% o 99% de polipéptidos de dominio CH3 correctamente plegados.

7. Población aislada de inmunoglobulinas que incluye la pluralidad de polipéptidos de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o fragmentos funcionales de los mismos según la reivindicación 5, comprendiendo dicha población de la reivindicación 5 una pluralidad de polipéptidos según la reivindicación 1.

8. Población aislada de polipéptidos de unión que incluye la pluralidad de polipéptidos de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o fragmentos funcionales de los mismos según la reivindicación 5, comprendiendo dicha población de la reivindicación 5 una pluralidad de polipéptidos según la reivindicación 1, fusionados con un dominio de unión diana.

9. Método para producir un polipéptido de unión dimérico, que incluye la combinación de un primer polipéptido que comprende un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo, que tiene una sustitución de Pro por Gly en la posición 38 (P38G) del dominio CH3 y un dominio de unión diana, con un segundo polipéptido que comprende un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo y un dominio de unión diana, presentando dicho dominio de región CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G una estabilidad aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G o fragmento funcional del mismo incluye además dos o más sustituciones de Pro por Gly; o porque dicho polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina comprende además una tasa de plegado aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido, comprendiendo opcionalmente dicha tasa de plegado aumentada un incremento seleccionado entre incrementos en un factor de aproximadamente 3, un factor 6, aproximadamente un factor 12 y aproximadamente un factor 18 o más; o porque dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G incluye adicionalmente un complejo dimérico que tiene un segundo polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina, comprendiendo opcionalmente dicho segundo polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina o fragmento funcional del mismo que tiene una sustitución de Pro por Gly en la posición 38 del dominio CH3 y presenta una tasa de plegado aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido, y comprendiendo opcionalmente dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G una inmunoglobulina.

11. Cantidad eficaz de un polipéptido de unión que incluye un polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina, o un fragmento funcional del mismo, para su utilización en el tratamiento de una afección patológica caracterizada por un crecimiento celular aberrante, teniendo dicho polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina, o fragmento funcional del mismo una sustitución de Pro por Gly en la posición 38 del dominio CH3 fusionada con un dominio de unión diana selectivo para una molécula diana expresada sobre la superficie de las células que intervienen en la afección patológica, y presentando dicho dominio de región CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G una estabilidad aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido.

12. Cantidad eficaz de un polipéptido de unión según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G o fragmento funcional del mismo comprende adicionalmente dos o más sustituciones de Pro por Gly.

13. Cantidad eficaz de un polipéptido de unión según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina presenta además una tasa de plegado aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido, comprendiendo opcionalmente dicha tasa de plegado aumentada un incremento seleccionado de entre incrementos en un factor de aproximadamente 3, un factor 6, aproximadamente un factor 12 y aproximadamente

un factor 18 o más.

14. Cantidad eficaz de un polipéptido de unión según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G comprende adicionalmente un complejo dimérico que tiene un segundo polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina; comprendiendo opcionalmente dicho segundo polipéptido de dominio de región CH3 de inmunoglobulina un polipéptido de dominio de región CH3 de

inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo que tiene una sustitución de Pro por Gly en la posición 38 del dominio CH3 y presenta una tasa de plegado aumentada en comparación con un dominio CH3 no sustituido; y comprendiendo opcionalmente dicho polipéptido de dominio CH3 de inmunoglobulina que tiene una sustitución P38G una inmunoglobulina.

15. Cantidad eficaz de un polipéptido de unión según la reivindicación 11, caracterizada porque dicha afección

patológica comprende adicionalmente cáncer; o se selecciona de entre el grupo consistente en cáncer de próstata, mama, pulmón y piel; o comprende adicionalmente una enfermedad infecciosa; o comprende adicionalmente una enfermedad autoinmune.

FIGURA 1 (continuación)

(continuación) AFECCIONES PATOLÓGICAS CANCEROSAS

Carcinoma mixto Sarcoma

Adenocarcinoma embrionario rabdomiosarcoma Tumores endometrioides Carcinoma de células grandes Adenosarcoma Carcin. neuroendocrino o de cél. en grano avena Celioblastoma (tumor de Brenner) Adenocarcinoma Carcinoma de células claras Carcinoma adenoescamoso Carcinoma no clasificado Carcinoma no diferenciado Tumor de células de la teca-granulosa Carcinoma Tumor de células de Sertoli-Leydig Adenoacantoma Disgerminoma Sarcoma Teratoma

MAMA

Tumor filoide Carcinoma Sarcoma Carcinoma in situ Enfermedad de Paget Carcinoma invasivo

SISTEMA ENDOCRINO

Adenoma Adenoma Carcinoma Carcinoma Meningioma Feocromocitoma Craneofarignioma Neuroblastoma Carcinoma papilar Paraganglioma Carcinoma folicular Pineal Carcinoma medular Pineoblastoma

Fibroelastoma papilar

HISTIOCITOSIS

Histiocitosis de células de Langerhans

FIGURA 4 (CONTINUACIÓN)

FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 FIGURA 10 FIGURA 11 FIGURA 12 FIGURA 13