Anticuerpos híbridos anti- integrina alfa V modificados genéticamente.

Un anticuerpo híbrido anti- integrina αv recombinante modificado genéticamente,

que comprende

(i) las regiones CDR de la cadena liviana:

CDR1 : RASQDISNYLA

CDR2: YTSKIHS

CDR3: QQGNTFPYT

(ii) las regiones CDR de la cadena pesada:

CDR1: SFWMH,

CDR2: YINPRSGYTEYNEIFRD,

CDR3: FLGRGAMDY;

(iii) las regiones armazón de la cadena liviana:

FR-1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC,

FR-2: WYQQKPGKAPKLLIY

FR-3: GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC

FR-4: FGQGTKVEIK

(iv) las regiones armazón de la cadena pesada

FR1: QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS

FR2: WVKQRPGQGLEWIG

FR3: KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS

FR4: WGQGTSVTVSS

y

(v) una región constante de la cadena pesada que se deriva de la IgG humana y una región de lacadena liviana constante humana.

Anticuerpos híbridos anti- integrina alfa V modificados genéticamente Área de la invención La presente invención hace referencia a anticuerpos modificados genéticamente que se unen de manera específica a receptores de integrina, especialmente a la subunidad del receptor de integrina alfa V. Los anticuerpos comprenden los sitios de unión al antígeno (CDRs, del inglés regiones determinantes de complementariedad) , de un anticuerpo anti- integrina de ratón conocido, además de secuencias variables de la cadena liviana híbridas, secuencias variables de la cadena pesada mutadas (Frs) y secuencias constantes de la cadena pesada modificadas. Los anticuerpos novedosos han mejorado las propiedades inmunogénicas y de expresión, y suscitan una actividad excelente anti-angiogénica además de anti-tumoral en humanos en monoterapia pero también, y sobre todo, en combinación con otros agentes inhibidores de la angiogénesis y de tumores, tales como cilengitide, cetuximab y agentes quimioterápicos.

Antecedentes de la invención El tratamiento del cáncer sigue siendo un problema muy importante en la atención sanitaria. Una estrategia propuesta para el tratamiento del cáncer es la inhibición de la angiogénesis y, de ese modo, la inhibición de la generación y el desarrollo de vasos sanguíneos, los cuales proporcionan al tumor los medios de crecimiento pertinentes. Una segunda estrategia es dirigir la inhibición de receptores específicos en las superficies de células tumorales, tales como la inhibición de Her2 mediante Herceptin® o la inhibición de EGFR mediante cetuximab (Erbitux®) .

Se considera que los inhibidores de las integrinas son agentes anti-tumorales potencialmente útiles, ya que las integrinas se expresan en la neovasculatura y actúan de mediadores en la angiogénesis. Además, las integrinas se expresan en ciertas células tumorales y pueden pomover de manera directa el crecimiento y la supervivencia tumoral.

Las integrinas no tienen ninguna actividad enzimática, pero las integrinas con la habilidad de enlazar sus ligandos (integrinas competentes para unir ligandos) se activan mediante la unión a proteínas de la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) . Las integrinas, por un lado, desencadenan cascadas de quinasas intracelulares para modular el crecimiento y la supervivencia celular, y por otro lado se asocian con el citoesqueleto para impulsar el acoplamiento y la locomoción celular. La integrina avº5 enlaza de manera específica la vitronectina, mientras que la avº3 también enlaza otras macromoléculas de la ECM provisional. La avº3 se observó por primera vez en el cáncer como un marcador dependiente de la progresión en el melanoma maligno. Aumentaba el ccrecimiento del melanoma in vivo y la supervivencia in vitro. Los bloqueantes de avº3 invirtieron estos efectos. Posteriormente, la avº3 se observó en otros tumores incluyendo el glioblastoma, carcinomas renales, carcinomas ováricos y otros. La avº3 se sobre-expresó ampliamente en las EC en muchos casos de malignidad. In vitro, los modelos angiogénicos activados mediante los factores de crecimiento derivados del tumor se sobre-expresaron y necesitaron la avº3 en la vasculatura que iba surgiendo, mientras que el bloqueo de la avº3 y la avº5 pudo suprimir el fenotipo angiogénico. También se mostró que la avº5 soporta la neo-vasculatura inducida por algunos factores de crecimiento derivados de tumores. La inhibición de la avº5 puede desencadenar la apoptosis de células tumorales.

Los receptores de integrina se encuentran sobre-expresados en los vasos sanguíneos invasivos del tumor, en los melanomas y algunos otros casos de malignidad, y modulan la respuesta celular a los factores de crecimiento. El compartimento vascular es una diana terapéutica prometedora ya que los tumores sólidos dependen de los vasos sanguíneos para el oxígeno, la nutrición, detoxificación y dispersión de las metástasis hematógenas; el cambio hacia el fenotipo angiogénico marca un paso discreto en la inducción de la malignidad, lo que resulta susceptible de intervención terapéutica; y la vasculatura experimenta cambio continuo, aunque las células endoteliales tienen una estabilidad genómica en relación al tumor, y son menos susceptibles de volverse resistentes a los fármacos a través de la mutación.

Un primer fármaco anti- integrina es el cilengitide y se considera que es un agente anti-tumoral de gran utilidad (Eskens FA, et al. (2003) Eur J Cancer 39:917-26) . Sin embargo, el cilengitide es una molécula pequeña que debe ser administrada con frecuencia. La estructura del cilengitide, forma de sal seleccionada por ejemplo, se encuentran reveladas en EP0770622, WO 0015244 y PCT/us07/01446 y se revelan en la presente patente a modo de referencia.

Un segundo fármaco anti-integrina es el mAb 17E6 (EMD 73034) de ratón, que inhibe de manera específica la subunidad de integrina av del receptor de integrina humana que porta células. El anticuerpo de IgG1 de ratón se describe, por ejemplo, por Mitjans et al. (1995; J.Cell Sci. 108, 2825) y en las patentes US 5, 985, 278 and EP 719

859. Las secuencias variables de la cadena pesada y liviana se representan en SEQ ID Nos. 25 y 26 (Figuras 20A, B) . Se generó 17E6 murino a partir de ratones inmunizados con av º3 humana inmovilizada con Sefarosa y purificada. Se fusionaron linfocitos del bazo de ratones inmunizados con células de mieloma, y uno de los clones de hibridomas resultantes produjo el anticuerpo monoclonal 17E6 (EMD 73034) . El mAb 17E6 de ratón es producido por la línea celular hibridoma 272-17E6 y se deposita bajo el número de accesión DSM ACC2160.

El 17E6 de ratón antagoniza la interacción de la integrina con la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) , y altera la función de las células endoteliales y tumorales. Los efectos principales del anticuerpo incluyen alterar la adhesión y desplazamiento de las células endoteliales (EC, por sus siglas en inglés) , induciendo su apoptosis, y suprimiendo la activación de las vías de los factores de crecimiento. El bloqueo mediante dicho anticuerpo suprime, de forma directa, la supervivencia tanto de las células endoteliales activadas como de algunas células tumorales.

Los anticuerpos monoclonales tales como el 17E6 son, en general, de utilidad para la inhibición de las interacciones extracelulares proteína-proteína, tal como la inhibición de las interacciones receptor-ligando. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales son, a menudo, difíciles de expresar y con frecuencia provocan una respuesta inmune, tal como una respuesta anti-idiotípica, lo que limita su eficacia.

Estos datos y conocimiento principal recopilados hasta el momento, han apoyado la necesidad del desarrollo de un anticuerpo 17E6 de ratón modificado con propiedades mejoradas que se una, de manera específica, a integrinas, que pueda ser expresado de manera eficiente, y que sea relativamente no inmunogénico en humanos como agente terapéutico en el cáncer. Un anticuerpo de tales características modificado genéticamente debería tener el potencial de suprimir el desarrollo del tumor tanto de forma indirecta, a través de la vasculatura del tumor, como de forma directa en las propias células tumorales.

Resumen de la invención La presente invención hace referencia a nuevos anticuerpos que presentan las características biológicas del anticuerpo 17E6 (EMD 73034) de ratón, pero con propiedades mejoradas sobre todo con respecto a la inmunogenicidad en humanos y a la expresión satisfactoria en los sistemas de expresión de mamíferos, a una escala de producción industrial y de fabricación.

La invención proporciona algunos anticuerpos modificados genéticamente que tienen secuencias modificadas, que reconocen el mismo epítopo receptor que el anticuerpo de ratón 17E6 pero muestran inmunogenicidad reducida en humanos y pueden ser expresados en mejor manera en comparación al anticuerpo no modificado.

Debe señalarse que modificar o modificar por ingeniería genética un anticuerpo derivado de ratón, a fin de obtener inmunogenicidad reducida en humanos, va, por regla general, acompañado por una pérdida significativa de expresión y/o de afinidad de unión. Así, la quimerización o humanización de acuerdo a técnicas estándar bien conocidas conduce de manera habitual a una disminución de la expresión, afinidad de unión, etc., lo que puede ser resuelto, únicamente de forma parcial, mediante retromutación específica u otras medidas. No pueden predecirse modificaciones dentro de una molécula de proteína respectiva que sean exitosas de manera simultánea con respecto a la inmunogenicidad reducida, expresión elevada y afinidad de unión satisfactoria. De este modo, disminuir la cantidad de... [Seguir leyendo]

REIVINDICaCIONES

1. Un anticuerpo híbrido anti- integrina av recombinante modificado genéticamente, que comprende

(i) las regiones CDR de la cadena liviana: CDR1 : RASQDISNYLA CDR2: YTSKIHS CDR3: QQGNTFPYT

(ii) las regiones CDR de la cadena pesada: CDR1: SFWMH, CDR2: YINPRSGYTEYNEIFRD, CDR3: FLGRGAMDY;

(iii) las regiones armazón de la cadena liviana: FR-1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC, FR-2: WYQQKPGKAPKLLIY FR-3: GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC FR-4: FGQGTKVEIK

(iv) las regiones armazón de la cadena pesada FR1: QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS FR2: WVKQRPGQGLEWIG FR3: KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS FR4: WGQGTSVTVSS y

(v) una región constante de la cadena pesada que se deriva de la IgG humana y una región de la cadena liviana constante humana.

2. Un anticuerpo modificado genéticamente de la reivindicación 1, en donde la región constante de la cadena pesada se deriva de la IgG2.

3. Un anticuerpo modificado genéticamente de la reivindicación 2, en donde dicha región constante de la IgG2 comprende una región bisagra de la IgG1 modificada.

4. Un anticuerpo modificado genéticamente de la reivindicación 3, en donde dicha región bisagra modificada de la IgG1 comprende la secuencia EPKSSDKTHTCPPCP.

5. Un anticuerpo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicha región constante de la IgG2 es modificada mediante la sustitución del aminoácido N con Q en la posición 297.

6. Un anticuerpo modificado genéticamente de la reivindicación 5, en donde el residuo de aminoácido F en la posición 296 es sustituído por A, a fin de eliminar un epítopo de linfocito T generado por la modificación en la posición 297.

7. Un anticuerpo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la región constante de la cadena liviana es kappa humana.

8. Un anticuerpo híbrido anti- integrina av recombinante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que consiste en

(i) secuencias de la cadena liviana constantes y variables:

y

(ii) secuencias de la cadena pesada constantes y variables:

9. Una proteína de fusión que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 fusionada en su C-terminal a una citocina o factor de crecimiento.

10. Una molécula de ADN que codifica un anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo, tal y como se ha especificado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un vector de expresión que comprende una molécula de ADN de la reivindicación 10.

12. Un sistema de expresión de proteínas que comprende una célula hospedadora mamífera transformada con el vector de expresión de la reivindicación 11, en donde una célula hospedadora humana es excluída.

13. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo, tal como se ha especificado en las reivindicaciones 1 a 9 en una cantidad farmacéuticamente efectiva, de manera opcional en conjunto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica que comprende un primer y un segundo agente farmacéuticamente efectivo, en donde el primer agente es un anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo, tal como se ha especificado en las reivindicaciones 1 a 9, y el segundo agente se seleccionó del grupo que consiste en: un agente terapéutico, un inhibidor de la angiogénesis y un agente anti-tumoral, de manera opcional en conjunto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14, en donde el agente antitumoral es un anticuerpo antitumoral.

16. Una composición farmacéutica de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo anti-tumoral es un anticuerpo anti- EGFR o un anticuerpo anti- Her2.

17. Una composición farmacéutica de la reivindicación 16, en donde el anticuerpo anti-tumoral es el anticuerpo anti-EGFR cetuximab o matuzumab.

18. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14, en donde el inhibidor de la angiogénesis es el inhibidor de la integrina cilengitide.

19. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14, en donde el agente quimioterápico es cisplatino, DTCI o darcabacina.

20. Un anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo modificado genéticamente, tal como se ha especificado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de tumores sólidos o metástasis tumorales.

21. Un anticuerpo modificado genéticamente de la reivindicación 20 para su uso de acuerdo a la reivindicación 20, en donde el efecto en el crecimiento tumoral es independiente del efecto anti-tumoral indirecto de dicho anticuerpo causado por su efecto bloqueante de la angiogénesis.

22. Una composición farmacéutica, tal como se ha especificado en las reivindicaciones 13 a 19, para su uso en el tratamiento de tumores.

23. Una composición farmacéutica, tal como se ha especificado en la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de tumores, en donde el anticuerpo anti-tumoral es un anticuerpo anti-EGFR, y dicho anticuerpo recombinante modificado genéticamente evita o retrasa un nuevo crecimiento del tumor después de la detención de la administración del anticuerpo modificado genéticamente.

24. Una composición farmacéutica de la reivindicación 23 para su uso de acuerdo a la reivindicación 23, en donde el primer agente terapéutico es el anticuerpo modificado genéticamente de la reivindicación 8 y el segundo agente terapéutico es cetuximab.

1B