Anticuerpos anti-miostatina.

Un anticuerpo monoclonal anti-miostatina o un fragmento funcional del mismo que se une específicamentea un polipéptido que consiste en aminoácidos 40-64 de una forma madura de miostatina humana como se muestraen la SEC ID NO: 46: **Tabla**

Anticuerpos anti-miostatina Campo de la invención La presente invención se encuentra en el campo de la medicina, en particular en el campo de los anticuerpos monoclonales contra la miostatina. En forma más específica la invención se refiere a la neutralización de anticuerpos monoclonales anti-miostatina que se unen a un epitopo novedoso identificado sobre la forma madura de la miostatitna. Los anticuerpos de la invención pueden ser murinos, quiméricos, o anticuerpos humanizados, inmunoconjugados de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Los anticuerpos de la invención son útiles en mamíferos para incrementar la masa muscular, aumentar la densidad ósea, o para el tratamiento de afecciones en las que la presencia de miostatina origina o contribuye a efectos patológicos indeseables o en las que una disminución en los niveles de miostatina contribuye a un efecto terapéutico deseable.

Antecedentes de la invención Los miembros de la superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformador beta (TGF-º) están involucrados en el desarrollo embriónico y en la homeostasis del tejido adulto. Los miembros de la superfamilia del TGF-β comparten una estructura común que incluye una secuencia de señal peptídica corta necesaria para la secreción de la proteína y un fragmento amino terminal que está proteolíticamente escindido aproximadamente 105 a 140 aminoácidos del terminal carboxi de la proteína precursora grande (“proproteína”) para producir la proteína madura. La proteína madura se caracteriza por los residuos de cisteína muy conservados, mientras que la forma activa de la proteína es un dímero enlazado por disulfuro de la proteína madura (Gray, A., and Maston, A., Science, 247:1328, 1990) . Además se han detectado heterodímeros de los miembros de la superfamilia del TGF-β y parecen tener diferentes propiedades biológicas que los homodímeros.

La miostatina, también denominada factor-8 de diferenciación del crecimiento (GDF-8) es un miembro de la superfamilia de proteínas del TGF-α. La miostatina se expresa principalmente en el desarrollo y el músculo esquelético adulto y funciona como un regulador negativo del músculo esquelético. La miostatina está muy conservada a través de las especies; la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la miostatina en el ser humano, el ratón, la rata y la vaca es100% idéntica. El epitopo inmunogénico identificado en la presente invención es 100% idéntico en el ser humano, el ratón, la rata, el pollito, el perro, el caballo, la cabra, la oveja, la vaca y el cerdo. El factor-11 de diferenciación del crecimiento, también denominado GDF-11 o BMP-11, es el miembro de la superfamilia de proteínas del TGF-β que es el más homólogo a la miostatina. La miostatina humana y el GDF-11 son 90% idénticos en el nivel aminoácido dentro de sus cadenas maduras.

La Patente Estadounidense número 5.827.733 enseña la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de la miostatina humana mientras que la Patente Estadounidense número 6.096.506 reivindica un anticuerpo específicamente reactivo con el polipéptido GDF-8 o un epitopo del mismo. La Patente Estadounidense número 2003/0138422 reivindica un anticuerpo que se une específicamente a una proteína del GDF-8 que comprende un péptido particular. La Patente Estadounidense número 6.468.535 reivindica un procedimiento para aumentar la masa muscular animal mediante la administración de un anticuerpo anti-GDF-8. La Patente Estadounidense número 6.368.597 enseña el uso de un anticuerpo GDF-8 para tratar la diabetes.

Actualmente hay tratamientos efectivos limitados para los trastornos o las afecciones que se beneficiarían de un incremento en la masa muscular y/o la resistencia muscular incluyendo la distrofia muscular, fragilidad, miopatía de cuidado intensivo, y caquexia que surgen del cáncer u otros trastornos, incluyendo pero sin limitación infección por VIH, cuidado intensivo y miopatías. Debido a su función como regulador negativo del crecimiento del músculo esquelético, la miostatina es una diana deseable para la intervención quirúrgica para estos trastornos. Existe una enorme necesidad terapéutica de obtener un medio para inhibir específicamente la actividad de la miostatina mientras no se inhiba o se inhiba mínimamente la actividad de otras proteínas de la superfamilia del TGF-β Además existe la necesidad terapéutica de disminuir específicamente el nivel de miostatina presente en un paciente mientras no disminuya de manera correspondiente el nivel de otras proteínas de la superfamilia del TGF-β. En particular, un anticuerpo monoclonal específicamente reactivo a la miostatina (por ej., que se une específicamente o reconoce la miostatina o una porción de la misma) y significativamente menos reactiva o no reactiva con otros miembros de la superfamilia de proteínas del TGF-β (por ej., GDF-11) puede proporcionar una terapia particularmente beneficiosa para incrementar la masa muscular y/o aumentar la resistencia muscular. De particular utilidad terapéutica son las formas quiméricas o humanizadas de este tipo de anticuerpo monoclonal. La miostatina es muy conservada en secuencia y en función a través de la especie; por lo tanto, no sólo puede este tipo de anticuerpo ser útil para el tratamiento de estos trastornos en humanos, sino además en otros mamíferos incluyendo, por ej., animales domésticos (por ej., canino y felino) , animales para el deporte (por ej., equinos) y animales para la alimentación (por ej., bovinos, porcinos, aves y ovinos) particularmente cuando las regiones de marco y constantes del anticuerpo se originan sustancialmente de la especie animal en la cual el anticuerpo debe ser terapéuticamente usado. Los anticuerpos anti-miostatina de la invención además pueden ser útiles para tratar trastornos o afecciones que se benefician de un incremento de los niveles de miostatina incluyendo, pero sin limitación, aquéllas que se benefician del incremento de la densidad ósea (por ej., osteoporosis) , diabetes tipo II, síndrome metabólico, obesidad, osteoartritis, sepsia, trastorno pulmonar obstructivo crónico (“TPOC”) y trastornos que están asociados con el desgaste muscular tales como enfermedad renal, enfermedad o insuficiencia cardiaca y enfermedad hepática.

Los anticuerpos anti-miostatina de la presente invención ofrecen ventajas sobre otros anticuerpos anti-miostatina en la técnica. La invención presenta la neutralización de anticuerpos monoclonales anti-miostatina capaces de unir un polipéptido que consiste de aminoácidos en los residuos 40-64 (por ej., SEC ID NO: 46 para miostatina humana) de la forma madura de miostatina y neutralizan una actividad de miostatina in vitro, in vivo o in situ. Dado que los miembros de la familia del TGF-β tiene un elevado grado de homología (por ej., la miostatina es aproximadamente 90% homóloga al GDF-11) se prefieren los anticuerpos anti-miostatina tales como los de la presente invención, que no son de reacción cruzada o de una reacción cruzada mínima con el GDF-11 que tiene una importante función en el establecimiento del patrón esquelético (McPherron, A., et al., Nature Genetics, 22:260-265, 1999) , para el uso terapéutico en comparación con los anticuerpos que tienen una reacción cruzada con el GDF-11 en un mayor grado.

Sumario de la invención Los anticuerpos monoclonales anti-miostatina, o sus fragmentos de unión al antígeno, que se unen específicamente

o reconocen un polipéptido que consiste de aminoácidos 40-64 de la forma madura de miostatina de origen mamífero, preferentemente humano, ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEC ID NO: 46) , o un polipéptido que consiste de la secuencia: ANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEC ID NO: 43) se describen en la presente invención. Estos anticuerpos se denominan en la presente “anticuerpos monoclonales de la invención” o “anticuerpos de la invención". Un anticuerpo monoclonal de la invención puede ser murino, quimérico, o anticuerpos humanizados, inmunoconjugados de estos anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Con preferencia, un anticuerpo monoclonal de la invención existe en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Con preferencia, un anticuerpo monoclonal de la invención se une a la miostatina (o bien la proproteína

o la forma madura de la proteína, monomérica o dimérica) dentro del dominio que abarca los aminoácidos ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEC ID NO: 46) y de esta forma antagoniza o neutraliza al menos una actividad o propiedad biológica in vitro, in vivo o in situ asociada con la miostatina o una porción de la misma.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal anti-miostatina o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente a un polipéptido que consiste en aminoácido.

4. 64 de una forma madura de miostatina humana como se muestra en la SEC ID NO: 46:

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, o un fragmento funcional del mismo, que es inhibido competitivamente de unirse a la miostatina humana madura por un anticuerpo monoclonal que comprende dos polipéptidos con secuencias seleccionadas de:

(i) SEC ID NOs: 3 y 2,

(ii) SEC ID NOs: 4 y 13,

(iii) SEC ID NOs: 3 y 14,

(iv) SEC ID NOs: 5 y 12,

(v) SEC ID NOs: 6 y 15,

(vi) SEC NOs: 7 y 17,

(vii) SECs ID NOs: 8 y 12, (viii) SECs ID NOs: 9 y 16,

(ix) SECs ID NOs: 10 y 12, y

(x) SEC ID NOs: 11 y 12.

3. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que se une a la miostatina con al menos 20 veces más de afinidad que con la que se une al GDF-11.

4. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 18, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 24, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

5. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 19, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 25, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 30, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 33, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 37.

6. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 18, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 24, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 31, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

7. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 20, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 25, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

8. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 20, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 26, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 30, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 34, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

9. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 18, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 24, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 35, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

10. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 18, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 27, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

11. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 21, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 28, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

12. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 20, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 24, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

13. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un péptido en la CDR1 de la LCVR con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 22, un péptido en la CDR2 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 23, un péptido en la CDR3 de la LCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 27, un péptido en la CDR1 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 29, un péptido en la CDR2 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 32, y un péptido en la CDR3 de la HCVR, con la secuencia como se muestra en la SEC ID NO: 36.

14. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de longitud total, un anticuerpo sustancialmente intacto, un fragmento Fab, un fragmento F (ab') 2 o un fragmento Fv de cadena simple.

15. El anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico.

16. El anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.

17. El anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que la región constante presente en el anticuerpo se origina a partir del genoma de un animal que se selecciona de animales domésticos, animales para el deporte y animales fuente de alimentación.

18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un portador aceptable para uso farmacéutico.

19. El anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como medicamento.

20. El anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso en la prevención o el tratamiento de pérdida de masa muscular, miopatía, distrofia muscular, debilidad muscular, fragilidad, caquexia, insuficiencia o enfermedad renal, insuficiencia o enfermedad hepática, insuficiencia o enfermedad cardiaca, diabetes tipo II, síndrome metabólico osteoporosis, obesidad, o TPOC en un humano.

21. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso para incrementar la masa muscular en un mamífero.

Figura 1 – Promiostatina Figura 2 – Miostatina madura (humana, murina, rata, pollo)

Figur.

3. Homología de miostatina con GDF-11

(SEC ID NO: 2) (SEC ID NO: 39) (SEC ID NO: 40)

Figura 4 – Alineamiento de región variable de cadena liviana de Fab

(SEC ID NO: 3)

(SEC ID NO: 4) (SEC ID NO: 3) (SEC ID NO: 5) (SEC ID NO: 6) (SEC ID NO: 7) (SEC ID NO: 8)

(SEC ID NO: 9) (SEC ID NO: 10) (SEC ID NO: 11)

Figura5 – Alineamiento de región variable de cadena pesada de Fab

3 (SEC ID NO: 12) 5 (SEC ID NO: 13) 5 7 (SEC ID NO: 14) 8 (SEC ID NO: 12) 9 (SEC ID NO: 15) 10 (SEC ID NO: 17) 11 (SEC ID NO: 12) 10 12 (SEC ID NO: 16) 14 (SEC ID NO: 12) 15 (SEC ID NO: 12)