Un procedimiento in vitro para inducir la proliferación de células endoteliales,

que aumenta la supervivencia de las células endoteliales, o que induce la angiogénesis, que comprende poner en contacto las células con un polipéptido Bv8 que tenga al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

Ácidos nucleicos y polipéptidos Bv8 con actividad mitógena.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a procedimientos, composiciones y ensayos que utilizan Bv8, una proteína con actividades mitógenas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Células endoteliales

El microambiente local afecta profundamente el fenotipo y las propiedades de crecimiento de las células endoteliales vasculares de una manera específica del tejido o el órgano, pero la naturaleza de las señales instructivas locales es en gran medida desconocida. Existe una evidencia convincente de que las familias del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y de la angiopoyetina de los factores de crecimiento específicos de las células endoteliales son esenciales para el desarrollo embriónico y para la angiogénesis en una variedad de circunstancias fisiológicas y patológicas (Ferrara y Alitalo, Nature Medicine, 5: 1359-1364 (1999) ; Carmeliet, Nature Medicine, 6: 389-395 (2000) ) . Existe también una fuerte evidencia de una regulación local específica de tejido del fenotipo y del crecimiento de las células endoteliales (Aird y col., J. Cell Biol., 138: 1117-1124 (1997) ; Stewart y Wiley, Dev. Biol., 84: 183-192 (1981) ) . Las características morfológicas de las células endoteliales varían ampliamente entre los diferentes órganos (Simionescu y Simionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988) pp. 355-398) . Además, el sitio de aplicación determina las propiedades de los nuevos vasos en incluso una extensión mayor que el tipo de factor angiogénico probado (Dellian y col., Am. J. Pathology, 149: 59-71 (1996) ; Roberts y col., Am. J. Pathology, 153: 1239-1248 (1998) ) . La base molecular de esta influencia del microambiente local sobre la vasculatura es desconocida, pero se cree que el estroma especializado juega un papel principal (Dellian, más arriba) . Posiblemente, una red integrada de estímulos, que puede incluir las proteínas secretadas específicas de tejidos, además de componentes de la matriz celular y extracelular, funciona para determinar le estructura y la función, así como la modulación del crecimiento del endotelio residente.

De esta manera, existe una necesidad actual de identificar y caracterizar factores que influencian el crecimiento y/o la diferenciación de las células endoteliales. Además de aumentar nuestro conocimiento del desarrollo de la vasculatura, dichos compuestos podrían ser útiles en el diagnóstico y el tratamiento de las dolencias asociadas con el tejido vascular.

Células secretoras de hormonas

Aunque se han hecho progresos en el avance de la ciencia y de las terapias médicas, sigue existiendo una necesidad de nuevos tratamientos para las dolencias médicas de la sociedad. Una solución para encontrar nuevos tratamientos ha sido estudiar cómo funciona el organismo. En particular, es de interés saber cómo las células señalizadoras controlan el comportamiento del organismo. Por ejemplo, las células endocrinas secretan moléculas de señalización denominadas hormonas en las que un mal funcionamiento de la secreción de estas hormonas puede conducir a una variedad de trastornos.

Las células especializadas en la secreción de hormonas incluyen las células de las gónadas, secretoras de testosterona (células de Leydig de los testículos) , estrógeno (células de la teca interna del folículo ovárico) y progesterona (células del cuerpo lúteo del folículo ovárico roto. Aunque existen una variedad de tratamientos en el campo médico que utilizan la administración exógena de testosterona, estrógenos y progesterona, permanece una necesidad de regular las células que producen estas hormonas.

Otras células especializadas en la secreción de hormonas incluyen las células de las glándulas adrenales y las células del sistema digestivo. Por ejemplo, las células de las glándulas adrenales secretan epinefrina, norepinefrina y hormonas esteroides tales como mieneralcorticoides y glucocorticoides. De particular interés es el cortisol, que está producido en la corteza de las glándulas adrenales y que influencia el metabolismo de muchos tipos de células. Las células del sistema digestivo incluyen aquellas del páncreas que secretan insulina. La insulina está secretada por los islotes de Langerhans y es esencial para el metabolismo de los carbohidratos. La insulina se usa en el tratamiento y el control de la diabetes mellitus, sin embargo, sigue existiendo una necesidad de tratamientos eficaces para trastornos tales como la diabetes. Otras hormonas de interés del tracto intestinal y respiratorio incluyen serotonina, endorfina, somatostanina, gastrina, secretina, colecistoquinina, glucagón y bombesina.

Existen numerosas enfermedades y trastornos asociados con las células secretoras de hormonas, en particular las células endoteliales esteroidogénicas en el interior de las glándulas endocrinas. Sería, por tanto, deseable identificar los factores de crecimiento que afectan específicamente a dichas células endoteliales. Dichos factores de crecimiento específicos de células endoteliales serían herramientas valiosas para diagnosticar y tratar los trastornos asociados con dichos tipos de células, ya para identificar además los fármacos candidatos útiles en el diagnóstico y tratamiento de dichas enfermedades.

Bv8

Bv8 es una proteína pequeña que se aisló originalmente de secreciones de la piel de la rana Bombina variegata (Mollay y col. Eur. J. Pharmacol: 374: 189-196 (1999) ) . Bv8 muestra más de un 40% de identidad con MIT1, una pequeña proteína del veneno de la mamba negra que ha demostrado ser muy potente induciendo la contracción intestina (Schweitz y col. FEBS Lett. 461: 183-188 (1999) ) . Se han clonado algunos homólogos de mamíferos de Bv8 de ratones y seres humanos y han demostrado tener secuencias aminoterminales idénticas (Wechselberger y col. FEBS Lett. 462: 177-181 (1999) ) . De forma igual que MIT-1, Bv8 humana ha demostrado contraer potentemente el músculo liso gastrointestinal, con CE50 en el intervalo subnanomolar (Li y col. Mol. Pharm.

59: 692-698 (2001) ) . Se han identificado dos formas de Bv8 en seres humanos, reflejando la forma más larga la presencia de un exón cortado y empalmado alternativamente. La forma más larga de Bv8 humana es aproximadamente un 78% homóloga y un 58% idéntica a VRPA, descrita en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº 09/886.242

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en la identificación de actividades novedosas de Bv8. En particular, se ha encontrado que Bv8 induce la proliferación en células endoteliales, promueve la supervivencia de células endoteliales y promueve la angiogénesis. Tal como se ha descrito en detalle en la presente memoria descriptiva, se pueden usar ácidos nucleicos y polipéptidos de Bv8 en numerosos ensayos y en diagnóstico y tratamiento de dolencias asociadas con las células endoteliales.

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro para inducir la proliferación de células endoteliales, aumentando la supervivencia de las células endoteliales, o induciendo la angiogénesis, que comprende poner en contacto dichas células con un polipéptido que tenga al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o una molécula de ácido nucleico que codifique dicho polipéptido. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto las células con Bv8 en una cantidad eficaz para inducir la proliferación de las células. El procedimiento puede comprender además poner en contacto las células con VEGF. En otra realización, el procedimiento comprende introducir ácido nucleico que codifica Bv8 en las células en una cantidad eficaz para inducir la proliferación celular, Este procedimiento puede comprender además introducir un ácido nucleico que codifica VEGF en las células.

En una realización, el Bv8 es un polipéptido Bv8 de la secuencia natural. Preferiblemente, el polipéptido Bv8 de la secuencia natural es un polipéptido Bv8 humano natural. El polipéptido Bv8 natural puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En otra realización, la secuencia natural de Bv8 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En otra realización el Bv8 es capaz de unirse a la heparina. En otra realización más Bv8 es una inmunoadhesina de Bv8. En una realización... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para inducir la proliferación de células endoteliales, que aumenta la supervivencia de las células endoteliales, o que induce la angiogénesis, que comprende poner en contacto las células con un polipéptido Bv8 que tenga al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto dichas células con VEGF o un ácido nucleico que codifica VEGF.

3. Un procedimiento in vitro de inhibir la proliferación de células endoteliales, la supervivencia de células endoteliales, o la angiogénesis, que comprende poner en contacto las células con un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales, o inducir la angiogénesis, y en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra el ácido nucleico que codifica Bv8.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células endoteliales son células de una glándula esteroidogénica.

5. Uso de un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales o inducir la angiogénesis, para la fabricación de un medicamento para regular la fertilidad en un mamífero, en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica Bv8.

6. Uso de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, en la preparación de un medicamento para tratar una dolencia asociada con un tejido productor de hormonas en un mamífero.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la dolencia es un trastorno dependiente de una hormona esteroide.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la dolencia es hiperplasia adrenal congénita lipoide, infertilidad, maduración sexual, tumor androgenodependiente, pubertad precoz, síndrome de McCune Albright, hiperplasia adrenal congénita, o hipogonadismo hipogonadotrópico.

9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el mamífero es un ser humano.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el medicamento comprende VEGF o un ácido nucleico que codifica VEGF.

11. Uso de un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales, o inducir la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad o dolencia asociada con una angiogénesis excesiva, no deseada, o incontrolada o la proliferación de células endoteliales en un mamífero en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica Bv8.

12. Uso de un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales, o inducir la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un mamífero en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica Bv8.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el cáncer es un cáncer dependiente de hormona.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el cáncer es cáncer de un órgano reproductor.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el órgano reproductor es ovario, testículo, útero,

o cuello del útero.

16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el medicamento comprende un antagonista de VEGF y el antagonista es un anticuerpo dirigido contra VEGF, un fragmento de anticuerpo dirigido contra VEGF que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra el ácido nucleico que codifica VEGF.

17. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en el que el polipéptido Bv8 es un polipéptido Bv8 de secuencia natural.

18. El procedimiento o uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el polipéptido Bv8 es un polipéptido Bv8 humano natural.

19. El procedimiento o uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el polipéptido Bv8 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6.

20. El procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en el que el polipéptido Bv8 se une a heparina.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que el polipéptido Bv8 es un polipéptido quimérico o inmunoadhesina.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido Bv8 comprende los ácidos nucleicos 11 a 400 de la SEQ ID NO: 1, los ácidos nucleicos 10 a 336 de la SEQ ID NO: 3; o los ácidos nucleicos 57 a 484 de la SEQ ID NO: 5.

23. Un procedimiento para identificar un antagonista de Bv8, que comprende:

a) poner en contacto una molécula candidata con un polipéptido Bv8 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4;

b) determinar la capacidad del polipéptido para promover la proliferación de células endoteliales, la supervivencia de las células endoteliales, o la angiogénesis; y

c) identificar una molécula candidata que inhiba la actividad de proliferación de células endoteliales, la actividad de supervivencia de células endoteliales, o la actividad de angiogénesis del polipéptido como un antagonista de Bv8.

24. Un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales o inducir la angiogénesis, para uso en la regulación de la fertilidad en un mamífero, en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra el ácido nucleico que codifica Bv8.

25. Un polipéptido de Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido para uso en el tratamiento de una dolencia asociada con un tejido productor de hormonas en un mamífero.

26. Un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales, o inducir la angiogénesis, para uso en el tratamiento de una enfermedad o dolencia asociada con una angiogénesis excesiva, no deseada o incontrolada o la proliferación de células endoteliales en un mamífero en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica Bv8.

27. Un antagonista de un polipéptido de Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales, o inducir la angiogénesis, para uso en el tratamiento del cáncer en un mamífero en el que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra el ácido nucleico que codifica Bv8.

28. El antagonista para uso en el tratamiento del cáncer en un mamífero de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el cáncer es un cáncer dependiente de hormona.

29. El antagonista para el uso en el tratamiento del cáncer en un mamífero de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el cáncer es cáncer de un órgano reproductor.

30. El antagonista para uso en el tratamiento del cáncer en un mamífero de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el órgano reproductor es ovario, testículo, útero, o cuello del útero.

31. El antagonista para uso en el tratamiento de una enfermedad o dolencia asociada con una angiogénesis excesiva, no deseada o incontrolada o la proliferación de células endoteliales en un mamífero de acuerdo con la reivindicación 26 o el antagonista para el uso en el tratamiento del cáncer en un mamífero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, que es para el uso con un antagonista de VEGF, en el que el antagonista de VEGF es un anticuerpo dirigido contra VEGF, un fragmento de anticuerpo dirigido contra VEGF que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica VEGF.

32. Una composición que comprende un antagonista de Bv8 en una premezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable, en la que la composición es para el uso que se define en cualquiera de las reivindicaciones 24 y 26 a 31; y

en la que el antagonista de Bv8 es un antagonista de un polipéptido Bv8 que tiene al menos un 80 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en la que dicho polipéptido es capaz de inducir la proliferación de células endoteliales, aumentar la supervivencia de las células endoteliales o inducir la angiogénesis, en la que el antagonista es un anticuerpo dirigido contra Bv8, un fragmento de anticuerpo dirigido contra Bv8 que se une a antígeno, o una molécula antisentido dirigida contra un ácido nucleico que codifica Bv8.

33. El procedimiento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-5 y 11-20 o el antagonista de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 .

2. 31, o la composición de acuerdo con la reivindicación 32, en el que el anticuerpo antagonista de Bv8 o el fragmento de anticuerpo que se une a antígeno es biespecífico.