ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE UN ACEITE COMESTIBLE MONOCELULAR QUE CONTIENE DHA,

ACIDO DOCOSAHEXANOICO, PARA EL PROPIO ACEITE Y PARA LOS USOS DEL ACEITE. UN MICROORGANISMO MARINO, COMO CRYPTHECODINIUM COHNII, SE CULTIVA EN FERMENTADORES Y SE INDUCE PARA QUE PRODUZCA EL ACEITE MONOCELULAR QUE POSTERIORMENTE SE RECUPERA MEDIANTE EXTRACCION CON DISOLVENTES.

Ácido docosahexanoico, procedimientos para su producción y compuestos que lo contienen.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un aceite unicelular comestible que contiene ácido docosahexanoico (DHA). La invención también se refiere a procedimientos para producir dicho aceite que contiene DHA con rendimientos comercialmente viables y a productos que contienen el aceite.

El DHA es un ácido graso omega-3 y es el ácido graso poliinsaturado (PUFA) de cadena larga más abundante en la materia gris del cerebro. Los ácidos grasos 3-omega en general se sabe que son beneficiosos para reducir la incidencia de la enfermedad coronaria [Lands, Fish and Human Health (1986) Academic Press]. Sin embargo, el metabolismo de los ácidos grasos 3-omega no se entiende bien. Por lo tanto, las dosificaciones clínicas exactas y la eficacia siguen siendo desconocidas.

Los peces marinos de agua fría son una fuente conocida de ácidos grasos 3-omega, incluyendo el DHA. La patente U.S. nº 4.670.285 divulga el uso de aceite de pescado procedente de peces tales como lacha y arenque como fuente de ácidos grasos omega-3 C22. En efecto, los aceites de pescado son la fuente comercial principal de ácidos grasos omega 3. Sin embargo, a menudo los aceites de pescado no se pueden usar para el consumo humano debido a la contaminación con contaminantes medioambientales tales como los PCB.

También hay problemas asociados con la recuperación de los aceites de pescado que contienen DHA para usos en alimentos. Dichos aceites a menudo huelen a pescado y tienen sabores desagradables asociados con los productos de oxidación de los ácidos grasos. Estos sabores y las toxicidades de los peróxidos hacen que los aceites no sean satisfactorios para usar en composiciones comestibles tales como alimentos infantiles y preparados para lactantes.

También se sabe que los microorganismos marinos contienen DHA. En particular, se sabe que diferentes especies de dinoflagelados contienen DHA. Harrington y col. en "The Polyunsaturated Fatty Acids of Marine Dinoflagellates" J. Protozoal, 17:213-219 (1970), caracteriza el contenido de ácidos grasos de ocho dinoflagelados marinos fotosintéticos y uno heterótrofo, y concluye que los dinoflagelados son un grupo productor principal de ácido docosahexanoico y contribuyen con una cantidad sustancial de dicho producto a la cadena trófica marina.

No se ha logrado el cultivo con éxito de dinoflagelados para producir un aceite comestible que contenga DHA. Los dinoflagelados en general crecen muy despacio y son sensibles a las fuerzas de corte. Guillard y col., Dinoflagellates, (1984) Academic Press. La técnica anterior describe que incluso una pequeña agitación en el recipiente de cultivo reduce el crecimiento de los cultivos. Sin embargo, dicha agitación sería necesaria para lograr la oxigenación adecuada para maximizar el crecimiento para la producción comercial.

Se cree que el DHA es esencial para el desarrollo adecuado del cerebro y la vista de los niños, porque como se ha señalado más arriba, es el PUFA de cadena larga más abundante en el cerebro y en la retina. Aunque existe una ruta metabólica en los mamíferos para la biosíntesis del DHA a partir del ácido linoleico de los alimentos, esta ruta es bioenergéticamente desfavorable [Crawford, P. AOCS. Short Course in Polyunsaturated Fatty Acids and Eicosanoids, pág. 270-295 (1987)] y se cree que los mamíferos, igual que los peces, obtienen la mayor parte de su DHA a partir de fuentes alimenticias. En el caso de los niños, la fuente más probable sería la leche humana. En efecto, el DHA es el PUFA omega3 C20 más abundante en la leche humana. Sin embargo, generalmente el DHA está ausente en los preparados para lactantes. La patente U.S. nº 4.670.285 describe un preparado para lactantes que contiene ácidos grasos omega-3. Sin embargo, los ácidos que se usan en ella se obtienen del huevo o aceite de pescado (Talapia) y tienen asociadas las características desagradables descritas previamente. Además, los aceites de pescado generalmente contienen otro ácido graso omega-3, el ácido eicosapentanoico (EPA), un componente que no conviene en los preparados para lactantes debido a sus prolongados efectos anticoagulantes y a la disminución de los niveles de ácido araquidónico en los niños. Esta se ha correlacionado con tasas reducidas de aumento de peso de los niños (Carleson y col. INFORM 1:306). En efecto, los niveles de EPA son muy bajos en la leche humana (menos de una cuarta parte del DHA).

De acuerdo con esto, es un objeto de la presente invención proporcionar un aceite comestible unicelular que contenga ácido docosahexanoico (DHA). Preferentemente este aceite no tendrá cantidades significativas de otros ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), es decir más de un 2% del total del contenido de ácido graso. En general es un objeto de la presente invención producir aceite unicelular con rendimientos comercialmente viables.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un aceite comestible unicelular, como se define en la reivindicación 1.

La presente invención también proporciona un procedimiento para producir un aceite comestible unicelular, como se El aceite, caracterizado aquí como aceite "de diseño", después de su extracción se puede usar en los preparados para lactantes, alimentos infantiles, complementos alimenticios y productos farmacéuticos.

Además, sería conveniente adquirir un mayor conocimiento de la ruta metabólica de los ácidos grasos omega-3. Respecto a esto, el DHA isotópicamente marcado sería de gran utilidad. Sin embargo, hasta el momento no se conoce ningún procedimiento para producir cantidades abundantes de DHA isotópicamente marcado. Por lo tanto, también es un objetivo de la presente invención proporcionar DHA isotópicamente marcado en suficiente cantidad para llevar a cabo dicha investigación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al cultivo de microorganismos, particularmente dinoflagelados, en un fermentador, la inducción de estos microorganismos para que produzcan cantidades importantes de aceite unicelular que contenga una alta proporción de DHA y la recuperación de dicho aceite. Tal como se usa aquí, "aceite unicelular" se refiere a un producto lipídico de un organismo unicelular.

La presente invención proporciona un procedimiento económico para obtener mayores niveles de aceites comestibles que contengan DHA. Adicionalmente, el procedimiento permite el cultivo comercial de dinoflagelados con densidades celulares elevadas.

Los aceites comestibles producidos por el procedimiento de esta invención no tienen sabores desagradables ni olores a pescado y tampoco tienen contaminantes medioambientales que se encuentran a menudo en los aceites que contienen DHA procedentes de fuentes convencionales.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1, 2 y 3 son ilustraciones gráficas de la acumulación de biomasa de C. cohnii frente al tiempo con la adición de diferentes nutrientes.

Descripción detallada del mejor procedimiento para poner en práctica la invención

De acuerdo con la presente invención, se cultivan microorganismos capaces de producir aceite unicelular que contenga DHA, en un fermentador en una solución de nutrientes capaz de sostener el crecimiento de dichos organismos. Preferiblemente el aceite unicelular contendrá al menos aproximadamente un 35% en peso de DHA.

En la presente invención se puede usar cualquier microorganismo capaz de producir un aceite comestible unicelular que contenga DHA. Por ejemplo, se pueden usar diatomeas fotosintéticas. Los microorganismos preferidos son los dinoflagelados marinos, incluyendo especies Crypthecodinium. Se prefiere especialmente el Crypthecodinium cohnii, un heterótrofo obligado que necesita un suministro de carbono reducido para su crecimiento. Se prefiere el C. cohnii porque contiene un perfil de ácidos grasos en el que el DHA es el único PUFA presente en cantidades suficientes (más de aproximadamente un 1% de la cantidad total de PUFA). Se han depositado muestras de estos organismos, designadas como MK8840, en la American Type Culture Collection at Rockville, Maryland, y número de acceso asignado 40750. Tal como se usa aquí, microorganismo o cualquier tipo específico de microorganismo, incluye cepas de tipo salvaje, mutante o recombinante. Cualquier microorganismo que produzca mayores niveles de aceite que contenga DHA se... [Seguir leyendo]

1. Un aceite comestible unicelular en el que el ácido docosahexanoico (DHA) constituye al menos un 35% en peso del aceite, siendo directamente obtenido tal aceite de un organismo unicelular por extracción de hexano.

2. El aceite según la reivindicación 1, que no contiene una cantidad significativa de ácido eicosapentanoico (EPA) .

3. El aceite según la reivindicación 1 ó 2, que se obtiene a partir de un dinoflagelado del género Cr y pthecodinium.

4. El aceite según la reivindicación 3, que se obtiene de Cr y pthecodinium cohnii.

5. Un procedimiento para producir un aceite comestible unicelular, en el que el ácido docosahexanoico (DHA) constituye al menos un 20% en peso de dicho aceite, cultivando un microorganismo capaz de producir dicho aceite unicelular en un fermentador para alcanzar una densidad celular de al menos 10 gramos de biomasa por litro de solución de nutrientes, recogiendo la biomasa y recuperando el aceite unicelular de la biomasa, en el que el microorganismo es un dinoflagelado y se induce al microorganismo a producir aceite unicelular en una concentración de al menos 1, 5 gramos por litro de solución de nutrientes por imposición de una fase estacionaria.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el microorganismo es del género Cr y pthecodinium.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el microorganismo es Cr y pthecodinium cohnii.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la solución de nutrientes comprende agua de mar o agua de mar artificial.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que la solución de nutrientes comprende agua de mar de salinidad reducida o agua de mar artificial de salinidad reducida.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que la solución de nutrientes comprende una fuente de carbono reducido y una fuente de nitrógeno orgánico.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la proporción entre la fuente de carbono reducido y la fuente de nitrógeno orgánico es equivalente a una proporción entre glucosa y extracto de levadura de entre 2 y 15 partes de glucosa por 1 parte de extracto de levadura.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que además comprende mantener un nivel de oxígeno disuelto de al menos un 10% de saturación de aire sustancialmente durante toda la fermentación.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que el microorganismo se cultiva a una densidad celular de al menos 20 gramos de biomasa por litro de solución de nutrientes.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, que comprende:

(a) añadir aproximadamente 106 células/ml (0, 5-1, 0 g de peso seco/litro) de C. cohnii a un fermentador que inicialmente contiene una solución de nutrientes que comprende agua de mar artificial de una concentración entre un cuarto y un medio, 1-8% de glucosa y 0, 4-0, 8% de extracto de levadura;

(b) cultivar dicho C. cohnii a una temperatura entre 15º C y 34º C y a un pH entre 5, 0 y 9, 0;

(c) añadir de forma creciente glucosa y extracto de levadura a dicha solución de nutrientes durante aproximadamente 56 horas;

(d) añadir más glucosa a dicha solución de nutrientes durante aproximadamente 16 horas adicionales para inducir en dicho C. cohnii la producción de aceite;

(e) mantener un contenido de oxígeno disuelto de al menos aproximadamente un 20% de nivel de saturación de aire durante dicho cultivo;

(f) recoger dicho C. cohnii después de entre 60 y 90 horas; y

(g) recuperar dicho aceite comestible unicelular.