Procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos,

que comprende: (a) tratar las células de los microorganismos que se desarrollaron en un medio de fermentación para liberar los lípidos intracelulares, en el que el tratamiento comprende el calentamiento de las células, la exposición de las células a condiciones básicas, y la exposición de las células a un compuesto quelante o sus combinaciones; (b) producir una mezcla separada en fases, que comprende una capa pesada en el que dicha capa pesada comprende una fase acuosa y una capa ligera en el que dicha capa ligera comprende dichos lípidos mediante separación gravitacional del producto de la etapa (a) (c) separar dicha capa pesada de dicha capa ligera (d) tratar dicha fase ligera para romper una emulsión formada entre dichos lípidos y agua; y (e) obtener dichos lípidos a partir de dicha capa ligera, en el que el procedimiento utiliza menos de 5% de un disolvente orgánico no polar, mientras que se evita la extracción del disolvente orgánico para obtener el lípido

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para extraer lípidos de microorganismos sin la utilización de cualquier cantidad significativa de un disolvente orgánico no polar.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un típico procedimiento para la preparación de lípidos de un microorganismo, tal como la producción del ácido graso altamente insaturado omega-3, y en particular, de una mezcla lipídica rica en ácido docosahexaenoico (DHA), implica el desarrollo de microorganismos que pueden producir el lípido deseado en un fermentador, estanque, o biorreactor, aislando la biomasa microbiana, secándola, y extrayendo lípidos intracelulares con un disolvente orgánico no polar, por ejemplo, hexano. Generalmente, los lípidos intracelulares de los microorganismos se extraen después de fragmentar (por ejemplo, lisando) las células secas de los microorganismos. Los lípidos extraídos pueden refinarse posteriormente para producir lípidos de una gran pureza y/o calidad. Los microorganismos se aíslan generalmente diluyendo el caldo fermentativo con agua, en primer lugar, y centrifugando (entonces) la mezcla para aislar los microorganismos. Las células se secan entonces y si los lípidos no se extraen inmediatamente o poco después, las células se empaquetan, por ejemplo, en bolsas (recipientes) precintadas al vacío, para evitar la degradación lipídica.

Desafortunadamente, el proceso de secado expone los microorganismos al calor, el cual puede dañarlos, por ejemplo, degradar la calidad de los lípidos, si (dicho proceso) se lleva a cabo de forma incorrecta. Las bolsas precintadas al vacío pueden desarrollar grietas, lo cual puede degradar posteriormente la calidad de los lípidos, debido a la exposición al aire de los microorganismos. Además, si los microorganismos que se han secado no se tratan con un antioxidante, los lípidos pueden degradarse posteriormente debido a la exposición al aire y o/a la luz. Por ejemplo, los carotenoides, xantófilas y ácidos grasos de cadena larga, como DHA, pueden degradarse, debido a la oxidación por el aire y/o la luz. Además, en algunos casos, los operarios que están expuestos a los microorganismos que se han sometido a secado, pueden desarrollar una reacción alérgica que crea un riesgo de seguridad y/o sanitario a los operarios.

Además, en una producción a escala industrial, la gran cantidad de disolventes orgánicos no polares volátiles e inflamables que se utilizan en la extracción lipídica, pueden crear condiciones operativas peligrosas. La utilización de disolventes orgánicos no polares en el procedimiento de extracción, puede requerir la utilización de un sistema de recuperación del aceite a prueba de explosión, que se añade, por lo tanto, al coste de la recuperación lipídica. Además, la utilización de un disolvente orgánico no polar para la extracción de los lípidos a partir de microorganismos, genera una corriente de residuos de disolventes orgánicos no polares que necesita un procedimiento apropiado de disposición, que aumenta posteriormente el coste productivo total de la extracción lipídica.

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Por tanto, es necesario un procedimiento de extracción lipídica a partir de microorganismos que no requiera la utilización de un disolvente orgánico no polar. También es necesario un procedimiento para la extracción lipídica a partir de los microorganismos que no requiera la cara etapa de secado de los microorganismos previa a la extracción.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención es tal como se describe en las reivindicaciones. Se da a conocer un procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos, que comprende:

(a) la lisis de células de microorganismos para producir una mezcla celular lisada.

(b) el tratamiento de la mezcla celular lisada para producir una mezcla separada en fases, que comprende una capa pesada y una capa ligera rica en lípidos;

(c) la separación de la capa pesada de la capa ligera rica en lípidos; y

(d) obtener los lípidos y/o las fracciones lipídicas a partir de la capa ligera.

Se da a continuación a conocer un procedimiento para obtener lípidos para microorganismos, que comprende:

(a) desarrollar microorganismos en un medio de cultivo;

(b) tratar dicho medio de cultivo y las células microbianas para liberar los lípidos intercelulares;

(c) someter el medio de cultivo que contiene los lípidos intercelulares liberados a separación gravitacional, para formar una fase ligera que contiene lípidos y una fase pesada;

(d) separar dicha fase ligera de dicha fase pesada;

(e) tratar dicha fase ligera para romper una emulsión que se ha formado entre dichos lípidos y el agua; y

(f) recuperar un lípido en bruto.

Se da a continuación a conocer un procedimiento para proporcionar la recuperación de lípidos a partir de microorganismos, que comprende las etapas que consisten en:

(a) desarrollar dichos microorganismos en un medio de cultivo;

(b) tratar las células de los microorganismos de dicho medio de cultivo sin secar dichas células, para liberar los lípidos intercelulares;

(c) someter el medio de cultivo que contiene los lípidos intercelulares liberados a separación gravitacional, para formar una fase ligera que contiene lípidos y una

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fase pesada;

(d) separar dicha fase ligera de dicha fase pesada;

(e) tratar dicha fase ligera para romper una emulsión que se ha formado entre dichos lípidos y el agua; y

(f) recuperar un lípido en bruto.

Preferentemente, los microorganismos se cultivan en un medio de fermentación en un fermentador. Alternativamente, los microorganismos pueden cultivarse fotosintéticamente, en un fotobiorreactor o estanque. Preferentemente, los microorganismos son microorganismos ricos en lípidos, más preferentemente, los microorganismos son seleccionados de entre el grupo constituido por algas, bacterias, hongos y protistas, más preferentemente, los microorganismos son seleccionados a partir del grupo formado por algas doradas, algas verdes, dinoflagelados, levaduras, hongos del género Mortierella,y Stramenopiles. Preferentemente, los microorganismos comprenden microorganismos del género Mortierella, género Crypthecodinium, y orden Thraustochytriales, y más preferentemente, son seleccionados microorganismos a partir del género Thraustochytrium, Schizochytrium o sus mezclas, más preferentemente, los microorganismos son seleccionados a partir del grupo formado por microorganismos que tienen las características identificadoras de ATCC nº 20888, ATCC nº 20889, ATCC nº 20890, ATCC nº 20891 y ATCC nº 20892, cepas de Mortierella schmuckerii, cepas de Crypthecodinium cohnii, cepas mutantes derivadas de cualquiera de los anteriores, y de sus mezclas.

El tratamiento de las células incluye un tratamiento para liberar los lípidos, tal como la lisis, la ruptura o la permeabilización. Tal como se utiliza en la presente Memoria, los términos lisis, lisar, lisado, etc., se utilizarán genéricamente para referirse a un tratamiento para liberar los lípidos intercelulares, que incluye la ruptura o la permeabilización de las células. Preferentemente, el tratamiento se selecciona a partir del grupo formado por el calentamiento de las células, su exposición a condiciones básicas, exponiéndolas a un compuesto quelante o a sus combinaciones. Más preferentemente, el lisado o ruptura de las células comprende su calentamiento hasta por lo menos 50ºC, mientras se las expone a condiciones básicas, a un compuesto quelante o a sus mezclas.

Preferentemente, la separación gravitacional comprende el paso del caldo fermentativo que contiene los lípidos intercelulares liberados a través de una centrífuga, tal como las centrífugas de tipo decantador, separador o (formadas) por discos apilados.

La mezcla celular que se ha lisado y separado, comprende una capa pesada que incluye una solución acuosa que contiene los materiales sólidos que provienen de las células lisadas, y una capa ligera que contiene lípidos. Las capas ligera y pesada pueden separarse mediante centrifugación. Los lípidos pueden encontrarse en un estado emulsificado. La capa ligera puede lavarse posteriormente con una solución de lavado acuosa hasta que los lípidos se convierten sustancialmente en no emulsificados. Preferentemente, el tratamiento para la ruptura de la emulsión comprende la mezcla de la emulsión con agua, alcohol, acetona o sus mezclas, y el sometimiento de la mezcla a la separación gravitacional. Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo sin utilizar disolventes orgánicos no polares tales como...

1. Procedimiento para obtener lípidos a partir de microorganismos, que comprende:

(a) tratar las células de los microorganismos que se desarrollaron en un medio de fermentación para liberar los lípidos intracelulares, en el que el tratamiento comprende el calentamiento de las células, la exposición de las células a condiciones básicas, y la exposición de las células a un compuesto quelante o sus combinaciones;

(b) producir una mezcla separada en fases, que comprende una capa pesada en el que dicha capa pesada comprende una fase acuosa y una capa ligera en el que dicha capa ligera comprende dichos lípidos mediante separación gravitacional del producto de la etapa (a)

(c) separar dicha capa pesada de dicha capa ligera

(d) tratar dicha fase ligera para romper una emulsión formada entre dichos lípidos y agua; y

(e) obtener dichos lípidos a partir de dicha capa ligera,

en el que el procedimiento utiliza menos de 5% de un disolvente orgánico no polar, mientras que se evita la extracción del disolvente orgánico para obtener el lípido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende el calentamiento de las células.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la solubilización de por lo menos parte de cualquier proteína presente en el medio de fermentación.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha etapa de solubilización de proteínas comprende el calentamiento del medio que contiene los lípidos intracelulares liberados.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (a) de tratamiento de las células, comprende el lisado de las células para producir una mezcla de células lisadas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la producción de una mezcla separada en fases en (b) comprende la centrifugación de dicha mezcla de células lisadas.

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7. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (a) de tratamiento comprende la adición de una base a dicho medio de fermentación.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha base disuelve un compuesto proteínico en el medio de fermentación, y en el que dicha base es seleccionada de entre el grupo constituido por hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos y sus mezclas.

9. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (a) de tratamiento comprende el calentamiento de dichos microorganismos a una temperatura de por lo menos 50ºC.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la etapa (a) de tratamiento comprende el calentamiento de las células hasta por lo menos 50ºC durante la exposición de las células a un compuesto básico, un compuesto quelante o sus mezclas.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el procedimiento se lleva a cabo sin secar dichas células.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha etapa (c) comprende además:

i) añadir una solución de lavado acuosa a dicha capa ligera;

ii) separar dicha solución de lavado acuosa de dicha capa ligera; y

iii) repetir dichas etapas (i) e (ii) hasta que el lípido se convierta en sustancialmente no emulsificado.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha capa ligera comprende un lípido emulsificado.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho lípido emulsificado comprende una suspensión de dicho lípido en una fase acuosa.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha solución acuosa comprende materiales celulares sólidos.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha separación gravitacional

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comprende el paso del medio de fermentación que contiene los lípidos intracelulares liberados a través de una centrífuga decantadora, separadora o de discos apilados.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha separación gravitacional comprende la centrifugación.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de rotura de la emulsión comprende la mezcla de la emulsión con agua, alcohol y/o acetona, y someter la mezcla a la separación gravitacional.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que el procedimiento se lleva a cabo en ausencia de un disolvente orgánico no polar.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que los lípidos obtenidos se someten a refinamiento, o tratamiento adicional para obtener un lípido refinado.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que los lípidos obtenidos son blanqueados y desodorizados.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos se obtienen a partir de un proceso de fermentación.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos pueden desarrollarse con un nivel de salinidad inferior a aproximadamente 12 g/l de cloruro sódico.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son microorganismos ricos en lípidos.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos comprenden por lo menos aproximadamente 20% en peso de lípidos.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son seleccionados de entre el grupo constituido por algas, hongos, bacterias y protistas.

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27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos comprenden microorganismos de entre el grupo constituido por algas doradas, algas verdes, dinoflagelados, levadura, hongos del género Mortierella y Stramenopiles.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos comprenden microorganismos del orden Thraustochytriales.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son seleccionados de entre el género Thraustochytrium, Schizochytrium y sus mezclas.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos son seleccionados de entre el grupo constituido por microorganismos que presentan las características identificadoras de la ATCC nº 20888, ATCC nº 20889, ATCC nº 20890, ATCC nº 20891 y ATCC nº 20892, cepas mutantes derivadas de cualquiera de los anteriores, y de sus mezclas.

31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que dichos microorganismos pueden producir por lo menos aproximadamente 0,1 gramos por litro por hora de colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, y ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega-6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinolénico y ácido gammalinolénico o sus mezclas.

32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o 16 a 18, en el que por lo menos aproximadamente 20% de dicho lípido es colesterol, fitosteroles, desmosterol, tocotrienoles, tocoferoles, ubiquinonas, carotenoides y xantófilas tales como beta-caroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, y ácidos grasos tales como ácidos linoleicos conjugados, ácidos grasos altamente insaturados omega-3 y omega6 tales como ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido dihomogammalinolénico y ácido gammalinolénico o sus mezclas.