Acetolactato sintasa y procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales.
Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por:
a. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :15, SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24, en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa;
b. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a), en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa; y,
c. una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico de (a) o (b) .
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/012040.
Solicitante: MARTEK BIOSCIENCES CORPORATION.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 6480 DOBBIN ROAD COLUMBIA, MD 21045 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: ROESSLER,Paul G, MATTHEWS,T. Dave, RAMSEIER,Tom M, METZ,James G.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01H13/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Algas (algas unicelulares C12N 1/12).
- C12N1/13 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N15/79 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes eucariotas.
- C12N9/88 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Liasas (4.).
PDF original: ES-2377557_T3.pdf
![Acetolactato sintasa y procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales.](https://patentados.com/img/2012/03/1200968/acetolactato-sintasa-procedimiento-transformacion-microorganismos-thraustochytriales.jpg)
Fragmento de la descripción:
Acetolactato sintasa y procedimiento para la transformación de microorganismos de Thraustochytriales.
Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una acetolactato sintasa de Thraustochytriales, incluyendo las acetolactato sintasas que confieren una sensibilidad reducida a compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase imidazolinona y/o oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre microorganismos del orden Thraustochytriales; a moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden marcadores seleccionables útiles para la transformación de microorganismos del orden Thraustochytriales y a procedimientos de transformación de tales microorganismos utilizando moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención. La presente invención también se refiere a promotores génicos útiles en sistemas de expresión de Thraustochytriales. Las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención pueden utilizarse para la expresión de ácidos nucleicos foráneos en un microorganismo de Thraustochytriales así como para la deleción, mutación o inactivación de genes en microorganismos de Thraustochytriales.
Antecedentes de la invención El desarrollo ha dado como resultado la revisión de la taxonomía de los traustoquítridos. Los teóricos de la taxonomía ubican a los traustoquítridos con las algas o protistas similares a algas. Sin embargo, debido a la incertidumbre taxonómica, sería lo mejor en el contexto de la presente invención considerar las cepas descritas en la presente invención como traustoquítridos (orden: Thraustochytriales; familia: Thraustochytriaceae; género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides o Japonochytrium) . Los cambios taxonómicos se resumen a continuación.
Las cepas de ciertos microorganismos unicelulares dadas a conocer y reivindicadas en la presente memoria son miembros del orden Thraustochytriales. Los traustoquítridos son eucariotas marinos con una historia taxonómica problemática. Los problemas con la colocación taxonómica de los traustoquítridos se han revisado por Moss (1986) , Bahnweb y Jackle (1986) y Chamberlain y Moss (1988) .
Por fines de conveniencia, los taxonomistas colocaron a los traustoquítridos al principio con otros eucariotas zoospóricos incoloros en los Phycomycetes (hongos similares a algas) . El nombre Phycomycetes, sin embargo, se eliminó con el tiempo del estado taxonómico, y los traustoquítridos se mantuvieron en los Oomycetes (los hongos zoospóricos biflagelados) . Se supuso inicialmente que los Oomycetes estaban relacionados con las algas heterocontas, y con el tiempo una amplia gama de estudios bioquímicos y ultraestructurales, resumidos por Barr (1983) apoyaron esta suposición. Los Oomycetes fueron de hecho aceptados por Leedale (1974) y otros ficólogos como parte de las algas heterocontas. Sin embargo, por razones de conveniencia que resultaban de su naturaleza heterotrófica, los Oomycetes y traustoquítridos se han estudiado en gran parte por micólogos (científicos que estudian hongos) en vez de ficólogos (científicos que estudian algas) .
Desde otra perspectiva taxonómica, los biólogos evolucionistas han desarrollado dos escuelas de pensamiento generales en cuanto a cómo evolucionaron los eucariotas. Una teoría propone un origen exógeno de los orgánulos rodeados por membrana a través de una serie de endosimbiosis (Margulis 1970) ; por ejemplo, las mitocondrias se derivaron de endosimbiontes bacterianos, los cloroplastos de cianofitas y los flagelos de espiroquetas. La otra teoría sugiere una evolución gradual de los orgánulos rodeados por membrana a partir de los sistemas no rodeados por membrana del ancestro procariota por medio de un proceso autógeno (Cavalier-Smith 1975) . Ambos grupos de biólogos evolucionistas, sin embargo, han retirado a los Oomycetes y traustoquítridos de los hongos y los colocan o bien con las algas cromofitas en el reino Chromophyta (Cavalier-Smith 1981) (este reino se ha expandido más recientemente para incluir otros protistas y los miembros de este reino se denominan ahora Stramenopiles) o bien con todas las algas en el reino Protoctista (Margulis y Sagan (1985) .
Con el desarrollo de la microscopía electrónica, los estudios de la ultraestructura de las zoosporas de dos géneros de traustoquítridos, Thraustochytrium y Schizochytrium, (Perkins 1976; Kazama 1980; Barr 1981) han proporcionado pruebas válidas de que los Thraustochytriaceae están sólo relacionados de manera distante con los Oomycetes. Adicionalmente, datos genéticos que representan un análisis de correspondencia (una forma de estadística multivariante) de secuencias de ARN ribosómico 5 S indican que Thraustochytriales son claramente un único grupo de eucariotas, completamente separados de los hongos, y lo más estrechamente relacionados con las algas rojas y marrones, y con miembros de los Oomycetes (Mannella et al. 1987) . La mayoría de los taxonomistas están de acuerdo con retirar a los traustoquítridos de los Oomycetes (Bartnicki-Garcia 1988) .
En resumen, utilizando el sistema taxonómico de Cavalier-Smith (1981, 1983) , los traustoquítridos se clasifican con las algas cromofitas en el reino Chromophyta, (Stramenopiles) . Esto los ubica en un reino completamente diferente de los hongos, que se colocan todos en el reino Eufungi. La colocación taxonómica de los traustoquítridos se resume por tanto a continuación:
Reino: Chromophyta (Stramenopiles) Phylum: Heterokonta Orden: Thraustochytriales Familia: Thraustochytriaceae Género: Thraustochytrium, Schizochytrium, Labyrinthuloides o Japonochytrium
Algunos taxonomistas pioneros separaron unos pocos miembros originales del género Thraustochytrium (aquellos con una fase de vida ameboide) en un género separado denominado Ulkenia. Sin embargo, es conocido en la actualidad que la mayoría, si no todos, los traustoquítridos (incluyendo Thraustochytrium y Schizoclaytrium) presentan fases ameboides y, como tal, algunos no consideran que Ulkenia sea un género válido. Tal como se utiliza en la presente memoria, el género Thraustochytrium incluirá Ulkenia.
A pesar de la incertidumbre de la colocación taxonómica dentro de clasificaciones superiores de Phylum y Reino, los traustoquítridos siguen siendo una agrupación distintiva y característica cuyos miembros siguen pudiéndose clasificar dentro del orden Thraustochytriales.
Los Schizochytrium y otros microorganismos de Thraustochytriales presentan un valor comercial potencial y actual sustancial debido a su capacidad para producir grandes cantidades de compuestos lipídicos, incluyendo ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) y diversos carotenoides (por ejemplo, astaxantina) . Los ácidos grasos altamente insaturados omega-3 son de interés comercial significativo porque se han reconocido recientemente como compuestos dietéticos importantes para prevenir arteriosclerosis y cardiopatía coronaria, para aliviar trastornos inflamatorios y para retrasar el crecimiento de células tumorales. Estos efectos beneficiosos son un resultado tanto de los HUFA omega-3 que provocan inhibición competitiva de compuestos producidos a partir de ácidos grasos omega-6, como de los compuestos beneficiosos producidos directamente a partir de los propios HUFA omega-3 (Simopoulos et al., 1986) . Los ácidos grasos omega-6 son los HUFA predominantes que se encuentran en plantas y animales. Por tanto, el desarrollo adicional de microorganismos de Thraustochytriales como organismos de producción comercial se beneficiará significativamente de la capacidad para producir cambios genéticos específicos en los organismos por medio de tecnología de ADN recombinante, incluyendo la potenciación de la producción de los carotenoides y HUFA altamente valiosos por tales organismos. Además, la capacidad para lograr una mejor comprensión de la bioquímica y biología molecular de este grupo escasamente caracterizado de organismos proporcionará información valiosa que puede utilizarse para guiar los futuros esfuerzos de desarrollo de cepas. Antes de la presente invención, sin embargo, los procedimientos y constructos recombinantes adecuados para transformar traustoquítridos, incluyendo miembros de los géneros Schizochytrium y Thraustochytrium, no estaban disponibles. De manera importante, no se disponía del desarrollo de marcadores seleccionables que son particularmente útiles para transformar microorganismos de Thraustochytriales y de la identificación de secuencias promotoras específicas de Thraustochytriales antes de la presente invención.
Los investigadores... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por:
a. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :15, SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24, en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa;
b. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) , en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa; y,
c. una secuencia de ácido nucleico que es completamente complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico de
(a) o (b) .
2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) , y en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa.
3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) , y en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa.
4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº :15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F.
5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :15, SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24, y en la que dicha proteína es una acetolactato sintasa.
6. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :14, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :23.
7. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la expresión de dicha proteína de (a) o (b) confiere una sensibilidad reducida a los compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales que se transforma con dicha molécula de ácido nucleico.
8. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24.
9. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :23.
10. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una acetolactato sintasa de Schizochytrium.
11. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 10, en la que la expresión de dicha acetolactato sintasa de Schizochytrium confiere una sensibilidad reducida a los compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales que se transforma con dicha molécula de ácido nucleico.
12. Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
13. Microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales que se transforma con un vector de expresión o un vector de direccionamiento que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 12.
14. Vector recombinante para la transformación de los microorganismos del orden Thraustochytriales, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa que confiere una sensibilidad
reducida a los compuestos seleccionados de entre el grupo constituido por: compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y oxibenzoatos de pirimidinilo, sobre un microorganismo del orden Thraustochytriales, en el que dicha acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:
a. una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24; y
b. una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) ;
en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
15. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicho vector recombinante es un vector de expresión.
16. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicho vector recombinante es un vector de direccionamiento.
17. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) .
18. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una acetolactato sintasa que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a) .
19. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere de SEC ID nº :15 en una sustitución, inserción o deleción de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada de entre el grupo constituido por: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W y 599F.
20. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha acetolactato sintasa presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :19, SEC ID nº :22 y SEC ID nº :24.
21. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre el grupo constituido por: los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :18, los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :21 y los nucleótidos 1260-3314 de SEC ID nº :23.
22. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia de control de la transcripción se selecciona de entre el grupo constituido por un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de ácido graso desaturasa de Thraustochytriales.
23. Vector recombinante según la reivindicación 14, en el que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº :18, SEC ID nº :21 y SEC ID nº :23.
24. Procedimiento para la transformación de las células de un microorganismo del orden Thraustochytriales, comprendiendo dicho procedimiento:
a. introducir en las células de un microorganismo del orden Thraustochytriales un vector recombinante tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23; y
b. seleccionar las células que se han transformado satisfactoriamente con dicho vector recombinante cultivando dichas células de (a) en un medio que contiene por lo menos un compuesto que es inhibidor para las células no transformadas, seleccionándose dicho compuesto de entre el grupo constituido por: un compuesto de sulfonilurea, un inhibidor de la clase de imidazolinona y los oxibenzoatos de pirimidinilo.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho vector recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a producirse por dicha célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína está asociada con la síntesis de un ácido graso seleccionado de entre el grupo constituido por ácido docosahexaenoico (DHA) , ácido docosapetaenoico (DPA) , ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido araquidónico (ARA) .
27. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido por: una ácido graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada con un complejo de policétido sintasa y una proteína asociada con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o a moléculas de triacilglicerol.
28. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína es una ácido graso desaturasa T-3 codificada por una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº :29.
29. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína es una ácido graso polienoico isomerasa.
30. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido por HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa, vitamina E y ácido lipoico.
31. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho vector recombinante en la etapa (a) comprende además una secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en dicho microorganismo de manera que un gen que comprende dicha secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante la recombinación homóloga con dicha segunda secuencia de ácido nucleico.
32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que dicha secuencia de ácido nucleico diana codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por lipasas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, proteínas implicadas en la síntesis de hidratos de carbono, proteínas implicadas en la síntesis de productos de rutas de isoprenoides, proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la pared celular, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos saturados, proteínas implicadas en las rutas de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados, proteínas asociadas con un complejo de policétido sintasa y proteínas asociadas con la incorporación de ácidos grasos a fosfolípidos o moléculas de triacilglicerol.
33. Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la etapa que consiste en introducir en dicha célula por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que va a expresarse, estando dicha secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
34. Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la etapa que consiste en introducir en dicha célula por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en dicho microorganismo de manera que un gen que comprende dicha secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante la recombinación homóloga con dicha segunda secuencia de ácido nucleico.
35. Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la etapa que consiste en introducir en dicha célula una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda proteína que va a expresarse por dicha célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
37. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que dicha secuencia de control de la transcripción se selecciona de entre el grupo constituido por un promotor de a-tubulina de Thraustochytriales, un promotor de acetolactato sintasa de Thraustochytriales, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de la ácido graso desaturasa de Thraustochytriales.
38. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una segunda secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana en dicho microorganismo de manera que un gen que comprende dicha secuencia de ácido nucleico diana se muta o inactiva mediante la recombinación homóloga con dicha segunda secuencia de ácido nucleico.
39. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº :9.
40. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho microorganismo es de un género seleccionado de entre el grupo constituido por Thraustochytrium, Labyrinthuloides, Japonochytrium y Schizochytrium.
41. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicho microorganismo es de una especie seleccionada de entre el grupo constituido por Schizochytrium sp., Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum, Thraustochytrium sp., Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum y Japonochytrium sp.
42. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha etapa de introducción se realiza mediante un procedimiento seleccionado de entre el grupo constituido por bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.
43. Microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales, transformado con un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en el que el microorganismo recombinante comprende un vector de expresión.
44. Microorganismo recombinante según la reivindicación 43, en el que dicha secuencia de control de la transcripción es un promotor que funciona en un microorganismo de Thraustochytriales.
45. Microorganismo recombinante según la reivindicación 44, en el que dicho vector recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una primera proteína para su producción por dicho microorganismo, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha primera proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
46. Microorganismo recombinante según la reivindicación 44, en el que dicha célula recombinante se transforma además con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina.
47. Microorganismo recombinante según la reivindicación 46, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico SEC ID nº :9.
48. Microorganismo recombinante según la reivindicación 47, en el que dicha molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a la bleomicina comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda proteína para su producción por dicha célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha segunda proteína está unida funcionalmente a una secuencia de control de la transcripción.
49. Microorganismo recombinante según la reivindicación 43, que comprende además por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína para su producción por dicha célula.
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Vacuna de ADN que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2, del 1 de Julio de 2020, de OSAKA UNIVERSITY: Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico con una inserción para uso en el tratamiento o la profilaxis […]
Anticuerpo anti-Notch 4 humano, del 1 de Julio de 2020, de EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD: Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras y […]