Un vector de virus Mononegavirales recombinante que alberga una unidad de transcripción adicional que comprende un gen extraño unido operativamente con una secuencia de inicio de gen (GS) de virus Mononegavirales cadena arriba y una secuencia de fin de gen (GE) de virus Mononegavirales cadena abajo,

caracterizado por que entre la secuencia de GS y un codón de inicio del gen extraño y entre un codón de detención del gen extraño y la secuencia de GE están localizadas una región no codificante 3' y una región no codificante 5' (sentido de genoma) de un gen de virus Mononegavirales, respectivamente, donde el gen extraño está flanqueado por las regiones no codificantes 3' y 5'

Esta invención se refiere a un vector de virus Mononegavirales recombinante que alberga una unidad de transcripción adicional que comprende un gen extraño unido operativamente con una secuencia de inicio de gen 5 (GS) de virus Mononegavirales cadena arriba y una secuencia de fin de gen (GE) de virus Mononegavirales cadena

abajo así como a una vacuna que comprende tal vector de virus Mononegavirales recombinante.

Los virus vivos que son capaces de replicarse en un hospedador infectado inducen una respuesta inmune fuerte y de larga duración contra sus antígenos expresados. Son eficaces provocando respuestas inmunes mediadas tanto de forma humoral como por células, así como estimulando rutas de citocinas y quimiocinas. Por lo tanto, los virus vivos atenuados ofrecen distintas ventajas con respecto a composiciones de vacuna basadas en inmunógenos inactivados o de subunidades que típicamente estimulan en gran medida solamente la rama humoral del sistema inmune.

A lo largo de la última década, la tecnología del ADN recombinante ha revolucionado el campo de la ingeniería genética de los genomas de virus tanto ADN como ARN. En particular, ahora es posible introducir genes extraños en el genoma de un virus de tal forma que después de la replicación del nuevo virus de vector en un animal hospedador se expresa una proteína extraña que puede ejercer efectos biológicos en el animal hospedador. Como tales, los virus de vector recombinantes se han aprovechado no solamente para el control y prevención de infecciones microbianas, sino también para concebir terapias diana para enfermedades no microbianas, tales como tumores malignos y en terapia génica.

20 La generación de virus ARN no segmentados de polaridad negativa (virus del orden Mononegavirales) completamente a partir de ADNc clonado mediante una técnica denominada “genética inversa”, descrita por primera vez en 1994 (Schnell et al., EMBO J., 13, 4195-4203, 1994) ha hecho posible usar también virus del orden Mononegavirales (MV) como vectores. Desde entonces se han publicado estudios que describen el uso de muchos virus del orden MV como vectores virales para expresar antígenos extraños obtenidos de un patógeno con el objetivo de desarrollar vacunas contra ese patógeno. El orden de Mononegavirales se clasifica en cuatro familias principales: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae y Bornviridae. Los virus que pertenecen a estas familias tienen genomas que están representados por una única molécula de ARN de sentido negativo (-), es decir, la polaridad del genoma del ARN es opuesta a la polaridad de ARN mensajero (ARNm) que se denomina sentido más (+). La clasificación de los principales virus MV humanos y veterinarios se presenta en la siguiente tabla: Tabla 1: clasificación de los virus dentro del orden de Mononegavirales

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La organización genómica y detalles del ciclo vital de virus del orden MV actualmente se comprende bien y se ha revisado por diversos autores (Neumann et al., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002; Whelan et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004; Conzelmann, K.; Curr. Top Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2003). Aunque los virus Mononegavirales tienen diferentes hospedadores y distintas propiedades morfológicas y biológicas, tienen muchas características en común, tales como la organización genómica y los elementos esenciales para su modo típico de replicación y expresión génica, ilustrando que se han originado de un ancestro común. Son virus envueltos que se replican en el citoplasma de la célula y producen ARNm que no se cortan y empalman.

Un virus Mononegavirales consiste en dos unidades funcionales principales, un complejo de ribonucleoproteína (RNP) y una envuelta. Las secuencias de genoma completo de virus representativos de los géneros de todas las familias que se han mencionado anteriormente se han determinado. Los genomas varían en tamaño de aproximadamente 9.000 nucleótidos a aproximadamente 19.000 y contienen de 5 a 10 genes. La estructura y la organización de los genomas de los virus MV son muy similares y están gobernadas por su modo particular de expresión génica. Todos los genomas de virus MV comprenden tres genes centrales que codifican: una nucleoproteína (N o NP), una fosfoproteína (P) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (L). La envuelta viral está compuesta de una proteína de matriz (M) y una o más glucoproteínas transmembrana (por ejemplo, proteínas G, HN y F) que desempeñan un papel en el ensamblaje/gemación del virus así como en la unión celular y/o entrada del virus. Dependiendo del género, el repertorio de proteína se extiende mediante proteínas accesorias que presentan ciertas funciones reguladoras específicas en la transcripción y en la replicación del virus o que están implicadas en reacciones del hospedador del virus (por ejemplo, proteínas C, V y NS). El orden de los genes de virus MV está altamente conservado con los genes centrales N y P en o cerca del extremo 3' y con el gen grande (L) en la posición distal 5'. El M, los genes de glucoproteína de superficie así como los demás genes accesorios están localizados entre los genes N, P y L.

En el complejo de RNP, el ARN genómico o antigenómico está estrechamente encapsidado con la proteína N y está asociado con la ARN polimerasa dependiente de ARN que consiste en la proteína L y P. Después de la infección de una célula, el complejo de RNP, pero el genoma de ARN desnudo, sirve como un molde para dos funciones de síntesis de ARN distintas, es decir, transcripción de ARNm subgenómicos y replicación de ARN genómico de longitud completa.

Todos los genes dispuestos en tándem están separados mediante denominadas estructuras de “unión de genes”. Una unión de genes comprende una secuencia de “fin de gen” (GE) conservada, una “región intergénica” (IGR) no transcrita y una secuencia de “inicio de gen” (GS) conservada. Estas secuencias son tanto suficientes como necesarias para la transcripción génica. Durante la transcripción cada gen se transcribe secuencialmente en ARNm mediante la ARN polimerasa dependiente de ARN viral que comienza el proceso de transcripción en el extremo 3' del ARN genómico en la primera secuencia de GS. En cada unión de gen la transcripción se interrumpe como resultado del desacoplamiento de la ARN polimerasa en la secuencia de GE. El reinicio de la transcripción tiene lugar en la siguiente secuencia de GS, aunque con una eficacia reducida. Como resultado de este proceso interrumpido, también denominado un proceso de “detención-inicio”, la atenuación de la transcripción tiene lugar en cada unión génica como resultado de lo cual los genes proximales 3' en un genoma de virus MV se transcriben de forma más abundante que los sucesivos genes cadena abajo. La forma modular de la transcripción de genes de virus MV en la que cada gen es parte de un cistrón separado o unidad de transcripción hace que estos virus sean extremadamente adecuados para la inserción y expresión de genes extraños. Cada unidad de transcripción en un genoma de virus MV comprende los siguientes elementos: 3'-GS-fase de lectura abierta (ORF)-GE-5'.

En los extremos genómicos 3' y 5' todos los genomas de virus MV tienen una región corta no transcrita denominada “líder” (aproximadamente 40-50 nt) y “remolque” (aproximadamente 20-600 nt), respectivamente. Las secuencias líder y remolque son secuencias esenciales que controlan la replicación del ARN genómico, encapsidación y empaquetamiento viral.

La tecnología de genética inversa y el rescate del virus MV infeccioso ha hecho posible manipular su genoma de ARN mediante su copia de ADNc. El mínimo complejo de inicio de la replicación requerido para sintetizar... [Seguir leyendo]

1. Un vector de virus Mononegavirales recombinante que alberga una unidad de transcripción adicional que comprende un gen extraño unido operativamente con una secuencia de inicio de gen (GS) de virus Mononegavirales cadena arriba y una secuencia de fin de gen (GE) de virus Mononegavirales cadena abajo, caracterizado por que entre la secuencia de GS y un codón de inicio del gen extraño y entre un codón de detención del gen extraño y la secuencia de GE están localizadas una región no codificante 3' y una región no codificante 5' (sentido de genoma) de un gen de virus Mononegavirales, respectivamente, donde el gen extraño está flanqueado por las regiones no codificantes 3' y 5'.

2. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que las regiones no codificantes 3' y 5' son de un gen que codifica una proteína de envuelta de un virus Mononegavirales, en particular de un gen M, G, F o HN.

3. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que las regiones no codificantes 3' y 5' son de un gen que codifica una proteína RPN de un virus Mononegavirales.

4. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 1-3, caracterizado por que el gen extraño codifica un antígeno de un patógeno.

5. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 1-3, caracterizado por que el gen extraño codifica un modulador inmune.

6. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 1-5, caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es un virus de la familia Rhabdoviridae.

7. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es un virus de la rabia.

8. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es un virus de necrosis hematopoyética infecciosa.

9. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 6-8, caracterizado por que las regiones no codificantes 3' y 5' son de un gen N, P, M o G.

10. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 6-9, caracterizado por que la unidad de transcripción adicional está localizada en una posición proximal 3' o entre los genes P-M, M-G o G-L.

11. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 1-5, caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es un virus de la familia Paramyxoviridae.

12. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es un virus de la enfermedad de Newcastle, virus del moquillo canino o virus de parainfluenza (bovina).

13. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 11-12, caracterizado por que las regiones no codificantes 3' y 5' son de un gen NP, P, M, F o HN.

14. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 11-13, caracterizado por que la unidad de transcripción adicional está localizada en una posición proximal 3' o entre los genes P-M, M-F, F-HN o HN-L.

15. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 11-14, caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es el virus de la enfermedad de Newcastle.

16. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que la unidad de transcripción adicional está localizada entre los genes F-HN.

17. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 15-16, caracterizado por que las regiones no codificantes son de un gen HN.

18. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 15-17, caracterizado por que el gen extraño codifica un antígeno de un patógeno aviar.

19. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con la reivindicación 15-18, caracterizado por que el gen extraño codifica una hemaglutinina (HA) de un virus de influenza, preferiblemente una hemaglutinina H5 o H7.

20. Un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1-19, 5 caracterizado por que el vector de virus Mononegavirales es un virus atenuado.

21. Una vacuna contra un patógeno microbiano, caracterizada por que comprende un vector de virus Mononegavirales recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1-20 en una forma viva o inactivada y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

22. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizada por que comprende 10 adicionalmente un adyuvante.

23. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 21-22, caracterizada por que comprende una cepa de vacuna adicional.