Virus del sarampión oncolítico.

Virus del sarampión recombinante basado en la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que codifica para un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa,

particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, particularmente en el que dicho gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2, particularmente en el que dicho virus del sarampión recombinante comprende una secuencia de ARN mostrada en la figura 4, 28 ó 29, particularmente mostrada en la figura 4.

Virus del sarampión oncolítico Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un virus del sarampión recombinante que comprende un gen suicida para su uso en el tratamiento de células cancerosas con resistencias primaria o secundaria frente a un virus del sarampión oncolítico sin actividad de gen suicida. Además, la presente invención se refiere a un virus del sarampión recombinante basado en el genoma de la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que comprende un gen suicida, que comprende una fusión de citosina desaminasa de levadura y uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, a un método y a un kit para preparar el virus del sarampión recombinante tal como se reivindica en el presente documento.

Antecedentes de la invención

A pesar del avance significativo en el pasado, por ejemplo en el desarrollo de agentes quimioterápicos, terapias basadas en anticuerpos, vacunación contra tumores y radioterapia, sigue existiendo una necesidad urgente y no satisfecha para el desarrollo de agentes terapéuticos y enfoques terapéuticos novedosos para el tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas relacionadas.

Aunque los enfoques de terapia génica son sustancialmente prometedores para tales tratamientos, y aunque se han observado resultados antitumorales en diferentes modelos de terapia génica, determinadas limitaciones, particularmente en la transferencia de genes de interés a las células tumorales, han obstaculizado el desarrollo adicional de tales enfoques.

En el pasado, se había observado ocasionalmente que las infecciones naturales o las vacunaciones con virus del sarampión daban como resultado remisiones espontáneas de los tumores, particularmente en tumores malignos hematológicos, tales como leucemias, dando como resultado la identificación del potencial oncolítico del virus del sarampión.

El virus del sarampión es un paramixovirus con envuelta, monocatenario, de sentido negativo, del género Morbillivirus que provoca la enfermedad infecciosa del sarampión, una infección del sistema respiratorio. El genoma del virus del sarampión contiene seis genes que codifican para ocho proteínas: la proteína de la nucleocápside (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), proteína de fusión (F), hemaglutinina (H) y proteína grande (L), y dos proteínas accesorias, denominadas C y V. El virus entra en las células diana por medio de una fusión de membrana independiente del pH. Las proteínas H y F están implicadas en la unión al receptor y la fusión de membrana, respectivamente. La entrada del virus del sarampión en las células se produce por medio de la interacción de la glicoproteína H de superficie con los dos receptores conocidos para el virus del sarampión: CD46, que está presente de manera ubicua en células nucleadas de primate, pero se sobreexpresa frecuentemente en tumores, y la molécula de señalización de activación linfocitaria (SLAM) que está ubicada principalmente en células B y T. CD46 es una proteína reguladora del complemento asociada a membrana que protege las células humanas frente a la lisis de complemento autólogo actuando como cofactor en la inactivación proteolítica de productos de complemento de C3b y C4b, proporcionando por tanto protección para células tumorales frente a la lisis mediada por complemento. El reconocimiento del receptor por parte de la proteína H conduce a cambios conformacionales de la proteína F que dan como resultado la fusión con membranas de célula diana y la posterior entrada viral. Las células infectadas, incluyendo las células tumorales, expresan las proteínas F y H virales en la superficie celular. El reconocimiento del receptor viral en células vecinas infectadas o no infectadas desencadena de manera similar una fusión célula a célula. Por tanto, el efecto citopático típico del virus del sarampión es la formación de agregados celulares mononucleares gigantes (sincitios).

La mayoría de las preparaciones de virus del sarampión usadas para las vacunas contra el sarampión o para la investigación del virus del sarampión oncolítico se basan en un virus del sarampión vivo atenuado derivado de la denominada cepa de vacuna de Edmonston, un aislado obtenido originariamente en 1954, que se usó para crear la línea celular Edmonston-Enders, y basándose en ésta, las líneas de simiente Edmonston A y B mediante pases en serie en células humanas y la posterior adaptación a fibroblastos embrionarios de pollo (CEF). Tuvo que interrumpirse el uso de la vacuna atenuada viva desarrollada originariamente basada en el linaje Edmonston B debido a su alta reactogenicidad. Mediante la atenuación adicional de las líneas Edmonston, Edmonston-Enders y Edmonston A y B, se desarrollaron derivados del sarampión adicionales (Edmonston-Enders: AIK-C, Edmonston Zagreb; Edmonston A: Schwarz; Edmonston B: Moraten).

A pesar del avance que se ha realizado desde el descubrimiento del potencial oncolítico del virus del sarampión, que se resume en un artículo de revisión reciente (Msaouel, P., Dispenzieri, A., y Galanis, E., Clinical testing of engineered oncolytic measles virus strains in the treatment of cáncer: An OverView, Curr Opin Mol Ther. 29; 11: 43-53), aún no ha llegado al mercado ningún producto terapéutico basado en el virus del sarampión oncolítico, hecho que, al menos en parte, puede deberse al potencial de los virus de tipo natural de provocar efectos

secundarios graves, y particularmente a las limitaciones técnicas en la fabricación de preparaciones de virus de alta pureza para uso clínico. Aunque el conocimiento creciente de la biología del virus del sarampión, así como el desarrollo de un sistema de genética inversa que permite rescatar cepas del virus del sarampión recombinantes y la modificación mediante ingeniería viral, han abierto nuevas oportunidades para el desarrollo del virus del sarampión como agente terapéutico en el tratamiento del cáncer, siguen existiendo varias limitaciones en los constructos que se usan en la actualidad.

Por ejemplo, muchos de los programas de investigación y desarrollo que se están siguiendo actualmente se basan en el trabajo de Martin Billeter y colegas (Radecke, F., Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dótsch, K, Christiansen, G., y Billeter, M., Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal 14 (1995) 5773-5784; documento WO 97/627). Basándose en la cepa de laboratorio de VS, Guy Ungerechts y colegas han sometido a prueba la eficacia oncolítica del virus del sarampión redireccionados mediante CEA y CD2 reforzados con genes suicidas en modelos de ratón inmunocompetente (Ungerechts et al., Molecular Therapy 15, 11 (27) 1991-1997; Ungerechts et al., Cáncer Investigation 67, 22 (27) 1939-1947; Ungerechts et al., Molecular Therapy 13, suplemento 1 (26) 373). Springfield ef al. (Molecular Therapy 9, suplemento 1 (24) 224) han sometido a prueba la expresión in vitro y la actividad enzimática de genes suicidas codificados por virus del sarampión recombinantes. Posteriormente, se ha demostrado que la secuencia del genoma viral clonado se desviaba con respecto a la secuencia de Edmonston B, siendo más próxima a la cepa Edmonston de tipo natural y teniendo sustituciones relacionadas con el subgrupo Edmonston (Parks et al., J. Virol. 75 (21) 91-92; Parks et al., J. Virol. 75 (21) 921-933).

Además, actualmente están rescatándose preparaciones de virus del sarampión a partir de líneas celulares que no se han aprobado para la producción de vacunas, tales como fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) o células de riñón embrionario humano 293, tanto complicando como aumentando de este modo los costes de la producción a gran escala de partículas de virus del sarampión recombinantes de conformidad con los requisitos de BPF.

Adicionalmente, se ha demostrado que, por ejemplo, tumores derivados de determinadas líneas celulares (por ejemplo, RPMI 8226 y HT18) eran resistentes al tratamiento con virus del sarampión oncolítico a pesar de repetidas inyecciones de virus (Peng KW, Facteau S, Wegman T, OKane D, Russell SJ. Non-invasive in vivo monitoring of trackable viruses expressing soluble marker peptides. Nat Med. (22);8:527-31).

Por tanto, sigue existiendo una necesidad continua de una composición farmacéutica mejorada que comprenda un virus del sarampión recombinante para su uso en el tratamiento de células cancerosas y métodos mejorados para la generación de tales composiciones farmacéuticas y tal virus del sarampión recombinante.

Objetos de la invención

Por consiguiente, en vista de los problemas de la técnica anterior, un primer objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica mejorada que comprenda... [Seguir leyendo]

1. Virus del sarampión recombinante basado en la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que codifica para un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, particularmente en el que dicho gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2, particularmente en el que dicho virus del sarampión recombinante comprende una secuencia de ARN mostrada en la figura 4, 28 ó 29, particularmente mostrada en la figura 4.

2. Composición farmacéutica que comprende un virus del sarampión recombinante basado en la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión que comprende un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, particularmente en la que dicho gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2 para su uso como medicamento, particularmente para su uso en el tratamiento de células cancerosas, más particularmente en la que las células cancerosas tienen resistencias primaria o secundaria frente a un virus del sarampión oncolítico sin actividad de gen suicida, más particularmente en la que dichas células cancerosas se identifican llevando a cabo la siguiente etapa:

(a) determinar el porcentaje de células vivas en una población de células derivadas de dichas células cancerosas 72 h, o preferiblemente 96 h, tras infectar dicha población con el virus del sarampión oncolítico con una multiplicidad de infección de 1, siendo un porcentaje del 4% o más de células vivas en dicha población, particularmente el 5% o más, más particularmente el 6% o más, indicativo de que dichas células cancerosas son resistentes de manera primaria o secundaria a un virus del sarampión oncolítico sin actividad de gen suicida.

3. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, en la que las células cancerosas se seleccionan de células cancerosas de carcinoma humano y sarcoma humano.

4. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2 ó 3, en la que dicho virus del sarampión oncolítico sin actividad de gen suicida es de la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión, que tiene particularmente una secuencia mostrada en la figura 1.

5. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que dicho virus del sarampión recombinante comprende una secuencia de ARN mostrada en la figura 4, 28 ó 29, particularmente mostrada en la figura 4.

6. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que dichas células cancerosas adicionalmente no responden a agentes quimioterápicos y/o radioterapia.

7. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que dichas células cancerosas se seleccionan de la lista de: células cancerosas de colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello y sarcoma.

8. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que dicho tratamiento es un tratamiento repetido, particularmente cada semana, o cada dos semanas, o cada tres semanas, o cada cuatro semanas.

9. Método para generar el virus del sarampión recombinante según la reivindicación 1, que comprende la etapa de:

(a) clonar (i) el genoma de la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión, y (ii) un gen suicida que comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, en un plásmido bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II, particularmente en el que dicho gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2.

1. Método según la reivindicación 9, que comprende además la etapa de:

(b) clonar genes N, P y L auxiliares del virus del sarampión, cada uno bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II, en al menos un vector, particularmente en el que los genes N, P y L auxiliares virales se clonan cada uno en un vector separado, particularmente un vector de plásmido, más particularmente en el que el método comprende las etapas de:

(ba) clonar genes N auxiliares del virus del sarampión bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II, en un primer vector, particularmente un vector de plásmido;

(bb) clonar el gen P auxiliar del virus del sarampión bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II en un segundo vector, particularmente un vector de plásmido;

(be) clonar el gen L auxiliar del virus del sarampión bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II en un tercer vector, particularmente un vector de plásmido.

11. Método según la reivindicación 9 ó 1, en el que la etapa (a) y/o (b), o (a), (ba), (bb) y/o (be), comprende además la etapa de eliminar supuestas secuencias de corte y empalme de dicho genoma y/o cualquiera de dichos genes auxiliares.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la etapa (a) da como resultado el plásmido que tiene la secuencia mostrada en la figura 4, 28 ó 29, particularmente mostrada en la figura 4.

13. Método según la reivindicación 1 u 11, en el que las etapas (ba) a (be) dan como resultado plásmidos que tienen las secuencias mostradas en las figuras 5, 6 y 7.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende además la etapa de (c) transfectar células huésped con plásmidos de las etapas (a) y (b), o (a) y (ba) a (be), particularmente células huésped de una línea celular certificada aprobada para la producción de vacunas, particularmente de líneas celulares Vero o MRC-5, particularmente que comprende además la etapa de (d) rescatar virus del sarampión recombinante de la célula huésped transformada en la etapa (c).

15. Kit que comprende:

(a) un plásmido que comprende (i) el genoma de la cepa Schwartz de la vacuna contra el sarampión, y (ii) un gen suicida, que comprende una fusión de una citosina desaminasa, particularmente citosina desaminasa de levadura, y una uracilo fosforribosiltransferasa, particularmente uracilo fosforribosiltransferasa de levadura, bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II, particularmente en el que dicho gen suicida comprende una secuencia mostrada en la figura 2, particularmente en el que el plásmido tiene la secuencia mostrada en la figura 4, 28 ó 29, más particularmente mostrada en la figura 4;

(b) al menos un plásmido que comprende los genes N, P y L auxiliares del virus del sarampión, cada uno en forma de un único gen bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II, particularmente en el que los genes N, P y L auxiliares virales se clonan cada uno en un plásmido separado, particularmente en el que los plásmidos tienen las secuencias mostradas en las figuras 5, 6 y 7.