La presente invención esta relacionada con la utilización de variantes del Péptido Activador de la Adenilato Ciclasa de Pituitariapara estimular el crecimiento y mejorar el sistema inmunológicode organismos acuáticos.

Las variantes del péptido fueron suministradas por inmersión, por inyección y como aditivo en la dieta alimenticia

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología agrícola, específicamente al uso de un polipéptido activador de adenilato ciclasa de pituitaria en el cultivo de organismos acuáticos. Cuando el péptido se aplica a organismos acuáticos por inmersión, inyección o como aditivo alimentario, se obtiene un aumento del apetito de estos organismos, una mayor tasa de crecimiento y supervivencia, una actividad inmunitaria superior y un aumento de la liberación de prolactina.

Antecedentes de la técnica

El polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) se aíslo por primera vez en 1989 a partir de hipotálamo bovino y se demostró que su capacidad de estimular la secreción de hormona del crecimiento es a través de la activación de la enzima adenilato ciclasa (Miyata y col. (1989) “Isolation of a novel 38 residue hypothalamic polypeptide which stimulates adenylate cyclase in pituitary cells”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 567-574). El PACAP pertenece a la familia peptídica que incluye secretina, glucagón y péptido vasoactivo intestinal (Arimura y Shioda (1995) “Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors: Neuroendocrine and endocrine interaction”. Front.

Neuroendocrinol. 16:53-88). En mamíferos, los precursores de PACAP y de la hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH) están codificados por dos genes diferentes (Hosoya y col. (1992) “Structure of the human pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) gen”. Biochim. Biophys. Acta. 1129: 199-206), al igual que en todas las especies submamíferas estudiadas hasta la fecha (aves, reptiles y peces), los péptidos GHRH y PACAP están codificados por el mismo gen y están contenidos en el mismo precursor (Montero y col. (2000) “Molecular evolution of the growth hormone-releasing hormone/pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide gene family. Functional implication in the regulation of growth hormone secretion”. Journal of Molec. Endocrinol. 25:157-168). El gen de PACAP se expresa fundamentalmente en el sistema nervioso central y periférico, en las fibras nerviosas que inervan los ojos, en el tracto respiratorio, en las glándulas salivares, en el tracto gastrointestinal, en los órganos del sistema reproductivo, en el páncreas y en el tracto urinario. Se sintetiza también en las glándulas suprarrenales, en las gónadas y en células inmunitarias (Sherwood y col. (2000) “The origin and function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily”. Endocrine Review 21:619-670). El PACAP exhibe diferentes funciones biológicas, lo que es coherente con su distinta distribución en diferentes tejidos y con su actividad hipofisiotrópica, neurotransmisora, neuromoduladora y vasorreguladora (Chatterjee y col. (1997) “Genomic organization of the rat pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor gene. Alternative splicing within the 59-untranslated region”. J. Biol. Chem. 272: 12122-12131).

Está implicado en la regulación de la división celular, la diferenciación y muerte celular (Sherwood y col. (2000) “The origin and function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily”. Endocrine Review 21:619-670).

El PACAP estimula la liberación de hormona del crecimiento (GH). El efecto del péptido sobre la liberación de GH se ha demostrado in vitro en varias especies de mamíferos, aves, anfibios (Hu y col. (2000) “Characterization and messenger ribonucleic acid distribution of a cloned pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor in the frog Xenopus laevis brain”. Endocrinol. 141:657-665) y peces (Anderson L. L. y col. (2004) “Growth Hormone Secretion: Molecular and Cellular Mechanisms and In Vivo Approaches”. Society for Experim. Biol. and Med. 229: 291-302). Hay pocos estudios sobre el efecto del PACAP sobre la secreción y liberación de GH in vivo. Hasta la fecha, es conocido que este péptido aumenta in vivo los niveles de GH en el plasma de ratas (Jarr y col. (1992) “Contrasting effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on in vivo and in vitro prolactin and growth hormone release in male rats”. Life Sci. 51: 823-830) y en plasma bovino (Radcliff y col. (2001) “Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide induces secretion of growth hormone in cattle”. Domestic. Animal. Endocrinol. 21: 187-196), mientras que no produce este efecto en ovejas hembra (Sawangjaroen y Curlewis (1994) “Effects of pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide (PACAP) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) on prolactin, luteinizing hormone and growth hormone secretion in the ewe”. J. Neuroendocrinol. 6: 549-555) y en seres humanos (Chlodera y col. (1996) “Effects of intravenously infused pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on adenohypophyseal hormone secretion in normal men”. Clin. Neuroendocrinol. 64: 242-246).

Estos descubrimientos sugieren que, en mamíferos, el efecto del péptido sobre la secreción de GH varía de especie a especie (Anderson y col. (2004) “Growth Hormone Secretion: Molecular and Cellular Mechanisms and In Vivo Approaches”. Society for Experim. Biol. and Med. 229:291-302).

Hasta ahora, no existen estudios en peces in vivo que muestren que la función de PACAP en la regulación de GH. Además, no existen antecedentes del uso de este péptido en la estimulación del apetito en organismos acuáticos. En crustáceos, no existe evidencia hasta ahora de la presencia de este péptido y la cascada de señales que regulan el crecimiento en estos organismos no es conocida.

El PACAP estimula además la liberación de prolactina por las células pituitarias en

mamíferos (Ortmann y col. (1999) “Interactions of ovarian steroids with pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and GnRH in anterior pituitary cells”. Eur. J. Endocrinol. 140:207214). Promueve la liberación de hormona estimulante de melanotropina/α-melanocito (MSH) por las células melanotróficas de la pituitaria (Vaudry y col. (2000) “Pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide and its receptors: from structure to functions”. Pharmacol. Rev. 52: 269364).

En peces, no hay estudios que muestren la actividad de este péptido en la liberación de prolactina in vivo, ni hay descubrimientos sobre su efecto en el desarrollo del color de peces.

En mamíferos, la función del PACAP sobre la función del sistema inmunitario está muy bien caracterizada y hay varias patentes que describen su uso en seres humanos como modulador de respuesta inmunitaria. Hasta ahora, no hay antecedentes en la bibliografía que expliquen la función del PACAP sobre el sistema inmunitario de organismos acuáticos.

Se ha clonado el gen que codifica PACAP de varias especies de vertebrados y de un protocordado (tunicado). En peces, se ha aislado de algunas especies de salmón y de pez gato (Sherwood y col. (2000) “The Origin and Function of the Pituitary Adenylate Cyclase-Activating olypeptide (PACAP)/Glucagon Superfamily” Endocrine Reviews 21(6): 619-670, carpa dorada (Leung y col. (1999) “Molecular cloning and tissue distribution of in pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide (PACAP) the goldfish”. Rec. Progr. Mol. Comp. Endocrinol. 338-388), pez cebra (Fradinger y Sherwood (2000) “Characterization of the gene encoding both growth hormone-releasing hormone (GRF) and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide”. Mol. and Cell. Endocrinol. 165: 211-219), trucha (Krueckl y Sherwood. (2001)) y trucha arcoiris (Krueckl y Sherwood. (2001) “Developmental expression, alternative splicing and gene copy number for the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and growth hormone-releasing hormone (GRF) gene in rainbow trout” Molec. and Cell. Endocrinol. 182: 99108). La patente US 5695954 protege el aislamiento y purificación de las secuencias nucleotídicas de genes que codifican el polipéptido GHRH-PACAP de pez, así como vectores y hospedadores que expresan estas secuencias con el objetivo de usarse para aumentar el crecimiento en peces, mediante transgénesis, introduciendo los constructor genéticos mencionados en huevos de pez fertilizados. Protege también un procedimiento para detectar peces transgénicos que contienen estas secuencias.

En esta patente, se notifican específicamente las secuencias de genes que codifican el...

1. Un procedimiento para aumentar la productividad del cultivo de peces o crustáceos que comprende alimentar o administrar un neuropéptido polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP), con la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14, a peces o crustáceos en cultivo en una cantidad eficaz para estimular su crecimiento o para aumentar su resistencia frente a enfermedades o ambos.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se usa para aumentar la secreción de prolactina y para mejorar la osmorregulación de los peces.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se usa para regular el apetito de organismos acuáticos.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se usa para mejorar el desarrollo de la coloración de peces y crustáceos ornamentales.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se obtiene mediante síntesis química.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se obtiene mediante tecnología recombinante.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el neuropéptido PACAP se usa sin purificación, contenido en el sobrenadante de E. coli fragmentadas que expresan PACAP.

8. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el neuropéptido PACAP se usa sin purificación, contenido en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que expresa PACAP.

9. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el neuropéptido PACAP se usa purificado a partir de sistemas de producción recombinantes.

10. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se aplica a peces o crustáceos mediante inyecciones periódicas cada 3 días a una concentración de 0,1 µg/g de peso del animal.

11. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se suministra a peces o crustáceos mediante baños de inmersión a intervalos de 1 a 4 días en agua dulce o agua salada, a una concentración entre 100 y 200 µg de PACAP por litro de agua.

12. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se suministra a peces o crustáceos en forma de un pienso formulado a una concentración de 5 mg de PACAP por kg de pienso.

13. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, en el que el neuropéptido PACAP se suministra a la tilapia Orechromis sp.

14. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, en el que el neuropéptido PACAP se suministra al pez gato Claria sp.

15. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, en el que el neuropéptido PACAP se suministra al salmón Salmon sp.

16. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, en el que el neuropéptido PACAP se suministra a la gamba Penaus sp.

17. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el neuropéptido PACAP se suministra a peces o crustáceos para prevenir o tratar infecciones causadas por agentes patógenos.

18. El uso del neuropéptido PACAP de la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14 en la preparación de una composición para tratar peces o crustáceos en cultivo para estimular su crecimiento.

19. El uso del neuropéptido PACAP de la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14 en la preparación de una composición para tratar peces o crustáceos en cultivo para aumentar su resistencia frente a enfermedades.

20. El uso del neuropéptido PACAP de la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14 en la preparación de una composición para el tratamiento preventivo o terapéutico de una infección causada por agentes patógenos en peces o crustáceos en cultivo.

21. El uso del neuropéptido PACAP de la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14 para estimular el crecimiento de peces y crustáceos en cultivo para mejorar la productividad.

22. El uso del neuropéptido PACAP de la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14 para aumentar la resistencia de peces y crustáceos en cultivo a enfermedades, para mejorar la productividad.

23. El uso del neuropéptido PACAP de la secuencia aminoacídica identificada como SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13 o SEC ID Nº 14 para la prevención o el tratamiento de infecciones causadas por agentes patógenos de peces y crustáceos en cultivo, para mejorar la productividad.