PÉPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER ASOCIADO CON EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) Y OTROS TUMORES EPITELIALES.

Péptidos para el tratamiento de cáncer asociado con el virus del papiloma humano (VPH) y otros tumores epiteliales La presente invención se refiere al campo de la Farmacología Molecular y, especialmente, al desarrollo de péptidos útiles para el tratamiento de tumores epiteliales asociados con VPH, ya que esto permite el bloqueo del domino de fosforilación de la Caseína Quinasa II (CKII) por interacción directa con dicho sitio. La CKII es una enzima de treonina/serina implicada en la proliferación celular y su localización intracelular principalmente es en el núcleo durante el proceso de transformación maligna (Tawfic S, Yu S, Wang H, Faust R, Davis A, Ahmed K, 2001, Histol. Histopathol. 16: 573-582). Basándose en los descubrimientos de altos niveles de CKII en diferentes tumores sólidos epiteliales, se ha supuesto que la fosforilación inducida por esta enzima es un acontecimiento importante en la transformación maligna y un marcador de la progresión tumoral (Seldin DC, Leder P, 1995, Science 267: 894-897) (Faust RA, Gapany M, Tristani P, Davis A, Adams GL, Ahmed K, 1996, Cancer Letters 101: 31-35). Por otra parte, la sobreexpresión de CKII en ratones transgénicos conduce a la tumorigénesis en las glándulas mamarias al aumentar las rutas de transducción de señales Wnt/beta-catenina en esas células epiteliales mamarias (Landesman-Bollag E, Romien-Mourez R, Song DH, Sonenshein GE, Cardiff RD, Seldin DC, 2001, Oncogene 20: 3247-3257). Entre los tumores epiteliales, los originados por VPH representan una gran fracción. Por ejemplo, la mayoría de los tumores genitourinarios están asociados con estos oncovirus y se ha demostrado la presencia de secuencias de ADN de VPH en el 99,7% de los tumores procedentes de células cervicales escamosas (Walboormers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Muñoz N, 1999, J. Pathol 189: 12- 19). De forma similar, la OMS ha dado parte de aproximadamente 500.000 pacientes con cáncer cervical anualmente en todo el mundo (Parkin DM, Laara E, Muir CS, 1980, Int. J. Cancer 41: 184-1972). En Cuba, 370 mujeres con cáncer cervical mueren anualmente debido a esta enfermedad (Organización Panamericana de la Salud, 1999, Basic Country Health Profiles for the Americas. Cuba, 206-219). Los VPH se clasifican en oncogénicos y no oncogénicos de acuerdo con si las lesiones progresan hacia una malignidad o no (Lorincz AT, Temple GF, Kurman RJ, Jenson AB, Lancaster WD, 1987, J. Natl. Cancer Inst. 79: 671-677). Los VPH-16 y -18 están asociados con neoplasia intraepitelial que generalmente progresa hacia malignidad y, además, los dos tipos de VPH están asociados con más de un 90% de las displasias y carcinomas cervicales (Fujinaga Y, Shimada M, Okasawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K, 1991 J. Gen. Virol 72: 1039-1044). Como aún no se dispone de una vacuna terapéutica o profiláctica para la erradicación de los tumores asociados con VPH, el empleo de inhibidores que se dirigen a la transcripción viral y a oncoproteínas virales se ha vuelto más atractivo. Se han usado biomoduladores, tales como IFN, con alguna eficacia en ciertas enfermedades asociadas con VPH tales como condiloma, verrugas plantares y papilomatosis respiratoria (Koromilas AE, Li S, Matlashewski G, 2001. Cytokine & Growth Factor Reviews 12: 157-170). En experimentos previos sobre células transformadas con VPH (HeLa), los presentes inventores han demostrado que la exposición continua a IFN alfa produce una reversión del fenotipo maligno de estas células con la inhibición concomitante de la expresión del ARNm de VPH (López-Ocejo O, Perea SE, Reyes A, Vigoa L, López-Saura P, 1993. J. IFN Res 13: 369-375). En el mismo modelo celular, los presentes inventores descubrieron que el IFN alfa modula el ARNm de VPH mediante la represión de la transcripción viral endógena (Perea SE, López-Ocejo O, García-Milián R, Araña MJ, 1995, J. IFN & Cytokine Res 15: 495-501). De acuerdo con los resultados obtenidos en líneas celulares, los presente inventores observaron que el tratamiento con IFN alfa modulaba la expresión de ARNm en un estudio piloto en pacientes con cáncer cervical (García-Milián R, Rios MA, Diaz D, Silveira M, Guilar O, Amigó M, Araña MJ, Perea SE, 1996, J. IFN and Cytokine Res 16: 709-713). A pesar de los descubrimientos prometedores sobre el uso de IFN como regulador de la expresión del ARNm de VPH, cada vez más datos indican una respuesta variable de IFN y se ha notificado un fenómeno de resistencia hacia esta citocina entre el 40 y el 50% de los pacientes durante ensayos clínicos (Arany I, Tyring SK, Stanley MA, Tomai MA, Miller RL, Smith MH, McDermott, DJ, Slade HB, 1999, Antiviral Res 43: 55-63). Algunas pruebas moleculares y clínicas indican que la oncoproteína E7 juega un papel fundamental en el fenómeno de resistencia a IFN. Por ejemplo, se ha notificado que E7 se une al factor de transcripción inducido por IFN (p48) afectando de esta manera a la respuesta al IFN al bloquear la activación de la transcripción (Barnard P y McMillan NAJ, 1999, Virology 259: 305-313). Además, también se ha notificado la alteración del factor regulador de IFN (IRF- 1) en presencia de E7 (Park JS, Kim EJ, Kwon HJ, Hwang ES, Namkoong SE, Um SJ, 2000, J Biol Chem 275: 6764- 6769) (Perea SE, Massimi P, Banks L, 2000, J Mol Med 5: 661-666). En ensayos clínicos, la respuesta a IFN se ha considerado dependiente de la expresión de E7 en las lesiones que contienen VPH (Frazer IH, McMillan NAJ, 1997, Papillomatosis and condyloma acuminate. Clinical Applications of the Interferons (R Stuart Harris and RD Penny, eds) pág. 79-90. Chapman and Hall Medical, Londres). La oncoproteína E7 juega un papel esencial en la transformación maligna inducida por estos virus oncogénicos. De esta manera, se ha demostrado que la inmortalización inducida por E7 de células primarias conduce a mutaciones y aberraciones cromosómicas desde el comienzo del proceso de inmortalización (Mougin C, Humbey O, Gay C, Riethmuller D, 2000, J. Gynecol Obstet. Biol. Reprod 29: 13-20). Por otra parte, los presentes inventores han demostrado que la transfección estable con el gen de E7 conduce al desarrollo de un fenotipo resistente a IFN en células tumorales sensibles (Moro A, Calixto A, Suárez E, Araña MJ, Perea SE, 1998, Bioch Bioph Res Comm 245:752-756). De forma similar, se ha notificado que la oncoproteína E7 se une y bloquea la función de genes supresores de tumores tales como el Retinoblastoma (Rb) 2 E02796490 07-11-2011   y la Proteína-3 de Unión al Factor de Crecimiento similar a la Insulina (IGFBP-3) a través de la Cys 24 y el dominio C-terminal respectivamente (Nevins JR, 1992, Science 258: 424-429) (Zwerschke W y Jansen-Durr P, 2000, Advances in Cancer Res 78: 1-29). De forma similar, los dobletes Ser 31/Ser 32 en la proteína E7 han mostrado ser sustratos para la enzima CKII. (Hashida T, Yasumoto S, 1990, Biochem. Biophys Res. Comm 172: 958-964) y este dominio es esencial tanto para la capacidad transformante de esta oncoproteína (Barbosa MS, Edmonds C, Fisher C, Schiller JT, Lowy DR, Vousden K, 1990, EMBO J 9: 153-160) (Chien W-M, Parker JN, Schmidt-Grimminger D-C, Broker TR, Chow LT, 2000, Cell Growth & Differentiation 11: 425-435) como para la inhibición de la cascada de señalización de IFN (Perea SE, López-Ocejo O, García Milián R, Banks L, Araña MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7: 503). Basándose en el papel del sitio de fosforilación de CKII en la resistencia del VPH a IFN y en el desarrollo de cáncer, el diseño de fármacos que bloqueen dicho dominio podría convertirse en una herramienta útil para la terapia del cáncer. Hasta ahora no se han descrito moléculas que inhiban el sitio de fosforilación de CKII en E7 o en otros sustratos celulares. En relación con la oncoproteína E7, sólo se han descrito péptidos que bloquean el sitio de unión a Rb (Cys 24) (Webster KR, Koleman KG, 1997, documento US5625031) (Oliff Al, Riemen MW, documento EP 0412762 A2 910213) y otras regiones C-terminales (39-98) (Pidder J-D, Zwerschke W, 2000, documento EP0969013). Hasta ahora se han descrito algunos candidatos de vacuna dirigidos a desarrollar una respuesta CTL específica de E7 de VPH en ensayos clínicos o preclínicos (Chen C, Wang CC, Hung C, Pardoll DM, Wu T, 2000, Vaccine 18: 2015-2022) (Chen CH, Ji H, Suh KW, Choti MA, Pardoll DM, Wu TC, 1999, Gene Ther 12:1972-1981). Sin embargo, los enfoques dirigidos a la respuesta CTL se enfrentan con diferentes obstáculos relacionados con la biología del VPH. Por ejemplo, los tipos oncogénicos de VPH regulan negativamente los antígenos del CMH de clase I que son esenciales para la respuesta CTL (Connor ME, Stem PL, 1990, Int J Cancer 46: 1029-1034). Además, la expresión de E7 se ha asociado con inmunosupresión local en el entorno tumoral y esto podría afectar también al desarrollo apropiado de la respuesta... [Seguir leyendo]

1. Péptidos que se unen e inhiben el sitio de fosforilación de la Caseína Quinasa II (CKII) que presentan las siguientes secuencias: a. CSVRQGPVQKC; b. CSSCQNSPALC; c. CQIPQRTATRC; d. CAKQRTDPGYC; e. CWMSPRHLGTC; f. CRNCTVIQFSC; g. CHYIAGTVQGC; h. CPLVSLRDHSC; i. CKQSYLHHLLC; j. CFQPLTPLCRC; k. CQSYHELLLQC. 2. Péptidos de acuerdo con la reivindicación 1, que presentan una estructura cíclica. 3. Péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, que están contenidos en un polipéptido de fusión. 4. Una composición farmacéutica que comprende uno o diferentes péptidos de las reivindicaciones 1-3 así como un vehículo apropiado. 5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 que contiene además una citocina. 6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 cuya citocina es un interferón (IFN). 7. Los péptidos de las reivindicaciones 1-3 para uso en la inhibición de la proliferación de células tumorales. 8. Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizados porque se inhiben tumores tanto asociados como no asociados con VPH. 9. Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso en el tratamiento de lesiones asociadas con VPH en estadios premalignos. 10. Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizados porque los péptidos se emplean junto con citocinas. 11. Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizados porque la citocina es un IFN. 12. Los péptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizados porque los péptidos se emplean para tratar a pacientes infectados por VPH resistentes al tratamiento con IFN. 13. Un vector de expresión de mamífero que contiene las secuencias de ADN que codifican cualquiera de los péptidos mostrados en las reivindicaciones 1-3. E02796490 07-11-2011   11 E02796490 07-11-2011   12 E02796490 07-11-2011   13 E02796490 07-11-2011   14 E02796490 07-11-2011   E02796490 07-11-2011   16 E02796490 07-11-2011   17 E02796490 07-11-2011