Esta invención se relaciona con un método de obtención de estructuras antigénicas agregadas,

capaces de potenciar la respuesta inmune a antígenos agregados administrados por vía sistémica y/o mucosal, así como con las estructuras químicas, formulaciones de dichas estructuras y su uso. A partir del uso de agentes o compuestos agregantes, delipidantes u oxidantes, se permite la liberación de lípidos de las partículas y la agregación de las mismas. El estado de agregación se puede provocar en el interior de la levadura variando las condiciones de incubación. Las estructuras resultantes pueden utilizarse adyuvadas y/o con varios antígenos, produciéndose sinergismo entre los componentes con respecto a la respuesta inmunogénica , pudiendo contener estabilizadores y preservos. Estas nuevas estructuras antigénicas son aplicables en la industria como formulaciones vacunales, preventivas o terapéuticas, para uso humano, veterinario y /o diagnóstico

Procedimiento de obtención de agregados antigénicos de la hepatitis B deslipidados y uso de los mismos.

La presente invención está relacionada con la rama médica, particularmente con el uso de nuevas formulaciones de vacunas.

El objetivo técnico de la invención propuesta es el desarrollo de un procedimiento para la preparación de estructuras antigénicas agregadas y sus formulaciones, capaces de potenciar la inmunogenicidad de los presentes antígenos administrados por vías sistémicas o mucosales.

La Patente EP 0 231 039 describe un procedimiento para la preparación de complejos inmunogénicos útiles como una vacuna.

La Patente EP 0 174 759 divulga partículas de agregados de proteínas útiles como una vacuna.

El procedimiento descrito en la presente invención genera estructuras agregadas antigénicas o antígenos en partículas, la adición de otros antígenos, componentes con características de agregación, deslipidación u oxidación, la post-selección de partículas agregadas entre 30-500 nm de tamaño, y la formulación de dichos agregados con los adyuvantes convenientes, favorece la inmunogenicidad de la composición antigénica resultante.

Desde que se sabe que el HBsAg es un inmunógeno eficaz, este fue el primer candidato de vacuna de un amplio uso en humanos y la primera vacuna recombinante anti-hepatitis B autorizada para uso universal. Las proteínas del HBsAg están auto-ensambladas en partículas de 22 nm (Heerman KH, Gerlich WH, Surface protein of Hepatitis B virus, A. McLachlan, ed. CRC Press, Boca Raton, Ann. Harbor, Boston, London, pág. 109, (1991)). La base molecular, celular y genética, de la respuesta inmune al HBsAg ha sido extensamente estudiada en un modelo múrido (Milich, DR., "Genetic and molecular basis for T- and B-cell recognition of hepatis B viral antigens", Immunol. Rev., vol. 99, pág. 71, (1987)). Anteriormente, se había estudiado la forma en que las variaciones de las propiedades físico-químicas del antígeno de superficie afecta su inmunogenicidad para células T restringidas clase I de MHC. Se obtuvo la evidencia de que únicamente se generó una respuesta CTL restringida clase I de MHC eficaz con una inyección de baja dosis del antígeno nativo en partículas de 22 nm o con monómeros desnaturalizados con detergentes sin adyuvante (Schirmbeck, R. y otros, Eur. J. Immunol., vol. 24, pág. 1088, (1994)). Igualmente, se ha investigado la inmunogenicidad de una preparación de agregados del antígeno de superficie de HBV obtenido mediante desnaturalización por calor para producir partículas de aproximadamente 1 µm de diámetro.

El tipo de transformación antigénica in vivo tiene una influencia fundamental sobre la eficacia de la respuesta de la célula T primaria, así como sobre el espectro de la subclase de la célula T implicada. En la presentación de péptidos al MHC evidentemente operan procedimientos alternativos para las células T restringidas CD4+ clase II del MHC y para células T restringidas CD8+ clase I del MHC (Germain, RN. y otros, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, pág. 403, (1993)). Se ha descrito una nueva vía endosómica para la transformación de partículas de HBsAg exógenas a los presentes epítopos restringidos clase I del MHC. Esta transformación de partículas de HBsAg exógenas de 1 µm de diámetro desnaturalizadas por calor se produce en macrófagos pero no en otros tipos de células y está acompañada con la regurgitación de péptidos antigénicos procedentes de la transformación del macrófago. Este procedimiento que genera péptidos restringidos clase I del MHC antígenos exógenos ha sido diseñado como una tentativa a la vía fagocítica. Las partículas de HBsAg de 22 nm nativas son transformadas fundamentalmente por los agregados de 1 µm y endocíticos por las vías fagocíticas. Además de la diferente transformación in vitro de estas dos preparaciones exógenas de HBsAg, su inmunogenicidad in vivo para la CTL clase I fue marcadamente diferente cuando se emplearon sin adyuvantes. La partícula de HBsAg nativa fue altamente inmunogénica en tanto que los agregados de antígenos de superficie desnaturalizados fueron de baja inmunogenicidad (Schirmbeck, R. y otros, J. Immunol., vol. 155, págs.. 4676-4684, (1995)).

Otros estudios realizados usando polarización por fluorescencia sugieren que la partícula de HBsAg está organizada como una bicapa lípida que reacciona con agregados de proteína (Sonveaux, N., Res. Virol., vol. 146, (No. 1), págs. 43-51, (1995)).

El tratamiento de HBsAg con cloroformo-metanol (2:1, v/v) y 1,1',3,3'-tetrametil-urea al 50%, no afectó la integridad morfológica de las partículas (mantuvieron su diámetro medio), aunque se liberó una parte importante de sus lípidos. La antigenicidad y la composición del polipéptido HBsAg no resultaron alteradas por la deslipidación (Neurath, AR., y otros, Intervirology, vol. 10, (No. 5), págs. 265-75, (1978)).

Teniendo en cuenta que las agregaciones de partículas no se han producido en las exigentes condiciones del procedimiento de producción, tal como la presencia de agentes caotrópicos, temperaturas moderadas y soluciones altamente concentradas, se ha estudiado la fuente de agregación de partículas del antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante usando una combinación de técnicas de inmunoafinidad y cromatografía de exclusión por tamaños molecular. La investigación de los factores que conducen a un incremente en la base del pico que corresponde al HBsAg en la cromatografía de exclusión molecular ha demostrado la existencia de agregados de partículas, además de la variabilidad de tamaño de la partícula de HBsAg (Tleugabulova, D., J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., vol. 707, (Nos. 1-2), págs. 267-73, (1998), Tleugabulova, D., Chromatographia, vol. 45, págs. 317-320, (1997)). Como un resultado de ello, el antígeno agregado se obtuvo en la fracción correspondiente a los agregados de partículas grandes pero no en la fracción en la que se encontró la proteína de HBsAg nativa; otro resultado de este artículo corrobora que los agregados están formados por partículas de 22 nm que migran como monómeros y dímeros en SDS-PAGE, así como el antígeno de superficie plegado correctamente (Tleugavuloba, D. y otros, Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., vol. 25, (No. 1-2), págs. 209-19, (1998)).

Divulgación de la invención

Uno de los objetivos de la presente invención es un procedimiento para la obtención de estructuras antigénicas agregadas de una inmunigenicidad mayor que los antígenos que las originan. Dicho procedimiento incluye las etapas siguientes:

A) Selección de los antígenos de interés.

B) Adición de uno o varios antígenos de la mezcla en un medio que favorece el procedimiento de agregación, pudiendo estar constituido dicho medio por medios químicos, agentes oxidantes u otros componentes con capacidad de agregación.

C) Incubación de la mezcla.

D) Selección del agregado de partículas con un tamaño entre 30 y 500 nm mediante un procedimiento que permite la retención de estos tamaños moleculares, tal como cromatografía de exclusión molecular, diafiltración y diálisis.

E) Preparación de las formulaciones mediante la mezcla de las estructuras antigénicas seleccionadas en la etapa (C) a través de la adición del adyuvante de elección e igualmente la potencial adición de otros antígenos, estabilizadores y conservantes.

Mediante el procedimiento de la presente invención pueden obtenerse diversos agregados que únicamente contienen el antígeno de superficie del HBV, incluyendo igualmente combinaciones del antígeno de superficie y otra lipoproteína, lipopéptido o antígenos homólogos o heterólogos lipídicos procedentes de cualquier patógeno viral, bacteriano, unicelular o multicelular.

De acuerdo con el procedimiento de la invención, los antígenos que son parte de las estructuras obtenidas en la etapa (B) pueden agregarse al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B mediante interacciones hidrófobas, electrostáticas o covalentes, que generan agregados de diferentes tamaños.

El procedimiento para la obtención de estructuras antigénicas permite la agregación de los antígenos nucleocápsidos de la hepatitis B, C o VIH contra el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; igualmente pueden agregarse antígenos procedentes de virus y bacterias tales como virus inactivados o proteínas de membrana exterior de patógenos bacterianos del tipo Neisseria...