TRANSFORMACIÓN Y REGENERACIÓN DE PLANTAS DE LA FAMILIA ALLIUM.

Un método para transformar Allium usando embriones inmaduros como fuente de explantes,

que comprende las siguientes etapas: (a) aislar embriones inmaduros de la planta de Allium a transformar; (b) transformar células de los embriones inmaduros con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector o plásmido adecuado, (i) hiriendo las células de los embriones, y transfiriendo las células de los embriones a una suspensión de agrobacterium; (ii) transfiriendo las células de los embriones de la etapa (i) a un medio de cultivo; (iii) cocultivando las células de los embriones; (c) seleccionar el material vegetal transformado derivado de la etapa b) transfiriendo células de los embriones a un medio selectivo; (d) cultivar el material transformado procedente de (c) en condiciones para la producción de embriones secundarios; (e) seleccionar cultivos transgénicos putativos; (f) transferir cultivos procedentes de (e) a un medio de regeneración para regenerar plantas

Campo de la invención

La invención se refiere a un método para transformar plantas de la familia Allium, y más particularmente a la transformación de plantas de cebolla.

Antecedentes de la invención

No existen protocolos publicados para la transformación y regeneración de especies de Allium. Las especies de las cosechas de Allium son probablemente las especies vegetales más económicamente importantes para las cuales no hay disponible ninguna tecnología de transformación. Para otras cosechas vegetales importantes, se han producido sistemas de transformación confirmados.

Inicialmente, se pensó que muchas monocotiledóneas no eran susceptibles a la transformación mediada por Agrobacterium. El desarrollo de técnicas de transferencia génica directa condujo pronto al bombardeo, siendo el método favorecido de la transformación de monocotiledóneas. Sin embargo, la transferencia génica directa no adolece de sus problemas. A menudo, se han observado en plantas transgénicas frecuencias bajas de transformación y una frecuencia elevada de patrones de integración inusuales. Recientemente, la transformación de monocotiledóneas mediada por Agrobacterium ha ganado adeptos, y ahora muchas especies de monocotiledóneas (incluyendo arroz, trigo, cebada, maíz y caña de azúcar) se han transformado usando este método. Un componente clave en el éxito de estos sistemas ha sido la transferencia de ADN a tipos celulares de callo (derivados habitualmente del precultivo de tejido embrionario), seguido de la regeneración a partir de estas células de callo usando protocolos precisos de selección después de la transformación. La transformación del callo de Allium no es útil, puesto que la regeneración a partir del callo es extremadamente difícil.

Recientemente, Haseloff (1997) ha modificado el gen gfp para potenciar su uso como un gen marcador transgénico en sistemas vegetales viables. La proteína fluorescente verde (GFP) permite a los investigadores seguir de forma precisa el destino de cualquier célula que exprese este gen, y optimizar así la supervivencia celular después de la transformación. Tal sistema ha sido útil en el desarrollo del protocolo de transformación de la cebolla dado a conocer aquí.

Como monocotiledóneas, las especies de Allium estaban predispuestas a ser reacias a la transformación. Las cebollas (Allium cepa L) son una cosecha con necesidades medioambientales diversas. Por lo tanto, no han sido estudiadas relativamente del todo con respecto a la aplicación de la biotecnología. Sólo hay unos pocos informes del suministro de ADN a especies de Allium (Klein 1987; Dommisse et al. 1990; Eady et al. 1996; Barandiaran et al. 1998). Tres trabajadores usaron transferencia génica directa, mientras que Dommisse et al. (1990) demostraron que puede ser posible la transformación mediada por Agrobacterium. Recientemente, se han publicado algunos informes de protocolos de regeneración para especies de Allium que son apropiados para estudios de transformación (Hong y Deberg 1995; Xue et al. 1997; Eady et al. 1998; Saker 1998). Sólo existe un informe sobre el desarrollo de agentes selectivos potenciales para uso en la transformación de Allium (Eady y Lister 1998a).

Objeto de la invención

Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar un método para producir plantas de Allium transgénicas, o para al menos proporcionar al público una elección útil.

En esta memoria descriptiva, se da a conocer el primer protocolo repetible para la producción de plantas de Allium transgénicas.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para transformar Allium usando embriones inmaduros como fuente de explantes, que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar embriones inmaduros de la planta de Allium a transformar;

(b) transformar células de los embriones inmaduros con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector o plásmido adecuado,

(i) hiriendo las células de los embriones, y transfiriendo las células de los embriones a una suspensión de agrobacterium;

(ii) transfiriendo las células de los embriones de la etapa (i) a un medio de cultivo;

(iii) cocultivando las células de los embriones;

(c) seleccionar el material vegetal transformado derivado de la etapa b) transfiriendo células de los embriones a un medio selectivo;

(d) cultivar el material transformado procedente de (c) en condiciones para la producción de embriones secundarios;

(e) seleccionar cultivos transgénicos putativos;

(f) transferir cultivos procedentes de (e) a un medio de regeneración para regenerar plantas.

**(Ver fórmula)**

Preferiblemente, los embriones se inoculan inmediatamente después de su aislamiento.

Preferiblemente, las plantas transformadas son cebolla (Allium cepa L).

Preferiblemente, los embriones se transforman usando un vector binario, y más preferiblemente un vector binario que posee un gen seleccionable.

Los embriones se pueden transformar preferiblemente con un gen selectivo para herbicidas.

Los ejemplos incluyen el gen bar o el gen ppt que codifica resistencia a fosfinotricina, o genes que codifican resistencia a glifosato. Sin embargo, se pueden usar otros genes.

Como alternativa, los embriones se podrían transformar con un gen selectivo para antibióticos. Un ejemplo es el gen de resistencia a canamicina o a geneticina, nptII.

Breve descripción de los dibujos

Ahora se describen realizaciones de la invención, sólo a título de ejemplo, con referencia a los dibujos, en los que:

La Figura 1 muestra a) expresión de GFP en tejido de embriones después de 5 días de cocultivo (x50). b) Expresión de GFP después de 2 semanas (x50). c) Sector de GFP después de un cultivo de 6 semanas (x25). d) Tejido positivo a GFP independiente (x5). e) Cultivo de brote de cebolla positivo a GFP (x5). f) Dos raíces negativas a GFP (izquierda) y dos raíces positivas a GFP (derecha) procedentes de plantas independientes (x10). g) Planta de cebolla transgénica (x0,2).

La Figura 2 muestra el análisis de Southern del gen gfp de transformante primario: plásmido Bluescript que contiene el gen gfp (sin cortar), control de número de copias de 1 (línea 1), control de número de copias de 10 (línea 2), blanco (línea 3), cebolla no transgénica (línea 4), 7 plantas de cebolla transgénicas (líneas 5-11), plásmido bluescript que contiene el gen gfp (sin cortar), control de número de copias de 1 (línea 12), control de número de copias de 10 (línea 13), blanco (línea 14), cebolla no transgénica (línea 15), 6 plantas de cebolla transgénicas (líneas 16-21).

La Figura 3 muestra una transferencia Southern de plantas transgénicas de aliinasa de raíz antisentido sondadas con el fragmento del gen gfp para indicar la presencia de la secuencia de T-DNA del pBINmgfpERantiroot. Línea 1, marcador de lambda hindIII; línea 2, pBINmgfpERantiroot de control equivalente de una copia; línea 3, pBINmgfpERantiroot de control de cinco copias; línea 4 cebolla no transformada, línea 5 cebolla de control positivo transformada con pBINmgfpER; línea 6-10 plantas transgénicas transformadas con pBINmgfpERantiroot (6 y 7 y 9 y 10 son clones separados); línea 11 pBINmgfpERantiroot de control equivalente de 1 copia, línea 12 pBINmgfpERantiroot de control de cinco copias.

La Figura 4 muestra un análisis de transferencia Western de niveles de aliinasa en las raíces de raíces de cebolla transgénica y no transgénica. Línea 1 control de aliinasa de raíz purificada; línea 2-5 niveles de aliinasa de las raíces de cuatro plantas transgénicas transformadas con el ADN de pBINmgfpERantiroot; línea 6 niveles de aliinasa de las raíces de una planta de control no transgénica típica.

Las Figuras 5 y 6 muestran un análisis de transferencia Southern de ADN digerido con HindIII procedente de plantas de cebolla transformadas con el T-DNA de pCambia 3301 modificado. Figura 5 sondada con sonda gfp. Figura 6 sondada con sonda del gen bar. Línea 1 y 2, controles de número de copias de 1 y 5 del plásmido pBINmgfpER, respectivamente (que contiene el gen gfp). Línea 3 ADN de cebolla no transgénica. Línea 4-6 clones de un transformante seleccionado del experimento 994. Línea 7-9 clones de un transformante procedente del experimento 9911. Línea 10-12 plantas transgénicas de control que contienen el gen gfp y no el gen bar. Línea 13-14, controles de 5 y 10 copias del plásmido... [Seguir leyendo]

1. Un método para transformar Allium usando embriones inmaduros como fuente de explantes, que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar embriones inmaduros de la planta de Allium a transformar;

(b) transformar células de los embriones inmaduros con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector o plásmido adecuado,

(i) hiriendo las células de los embriones, y transfiriendo las células de los embriones a una suspensión de agrobacterium;

(ii) transfiriendo las células de los embriones de la etapa (i) a un medio de cultivo;

(iii) cocultivando las células de los embriones;

(c) seleccionar el material vegetal transformado derivado de la etapa b) transfiriendo células de los embriones a un medio selectivo;

(d) cultivar el material transformado procedente de (c) en condiciones para la producción de embriones secundarios;

(e) seleccionar cultivos transgénicos putativos;

(f) transferir cultivos procedentes de (e) a un medio de regeneración para regenerar plantas.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que las plantas son cebollas.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la planta se transforma con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector que posee un gen seleccionable.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el gen seleccionable es un gen de resistencia a herbicida.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que el gen de resistencia a herbicida es el gen bar o un gen de resistencia a glifosato.

6. Un método según la reivindicación 3, en el que el gen seleccionable es un gen de resistencia a antibiótico.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que el gen de resistencia a antibiótico es el gen nptII.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la planta se transforma con un constructo de gen de aliinasa antisentido.