Transferasas, epimerasas, polinucleótidos que las codifican y usos de los mismos.

Un método para producir en una célula vegetal o planta con ascorbato aumentado relativo a una planta de control adecuada no incluyendo una planta con una mutación quede como resultado ascorbato disminuido,

comprendiendo el método transformación de una célula vegetal o planta con un polinucleótido que codifica que un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEC ID Nº 1 a 11, o una variante del polipéptido, en el que la variante presenta la actividad de una GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa, y en el que la variante comprende al menos uno de:

a) la secuencia de aminoácidos: AINVSPIEYGHVLLIP (SEC ID Nº 12),

b) la secuencia de aminoácidos: GYNSLGAFATINHLHFQAY (SEC ID Nº 13) y

c) una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencias para la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 11.

Transferasas, epimerasas, polinucleótidos que las codifican y usos de los mismos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para producir plantas con actividad de la GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa modificada y/o actividad de la GDP-D-Manosa epimerasa modificada y/o contenido en ácido ascórbico modificado.

Antecedentes El ascorbato es el antioxidante soluble más abundante en las plantas y es también un nutriente esencial para los seres humanos y algunos otros animales. El ascorbato contribuye de manera significativa al aporte total de “eliminadores de radicales libres” o “metabolitos antioxidantes” en la dieta humana. Ahora muestras convincentes demuestran que tales metabolitos bien por separado o en asociación, benefician a la salud y al bienestar, actuando como agentes anticancerígenos y protegiendo contra cardiopatía coronaria.

Casi todo el aporte dietético de ascorbato en los seres humanos procede de productos vegetales. El contenido en ascorbato de los tejidos vegetales, sin embargo, es notablemente variable. Aunque el contenido en ascorbato de la hoja es generalmente alto y relativamente uniforme en plantas herbáceas y leñosas, se encuentra una variabilidad enorme e inexplicable en el contenido en ascorbato en tejidos de plantas comestibles no verdes. Por ejemplo, en frutas, los niveles varían desde hasta 30 mg gFW-1 (gramos de Peso Fresco, por sus siglas en inglés) AsA en el camu camu de Mirciaria dubia, a menos de 3 µg gFW-1 AsA en el níspero de Mespilus germanica (Rodriguez et al. 1.992, J Chromatogr Sci, 30: 433-437) . Se ha indicado un intervalo de valores para ascorbato en kiwis (Ferguson, A. R., Nomenclatura botánica: Actinidia chinensis, Actinidia deliciosa y Actinidia setosa. Kiwifruit: science and management, ed. I. J. Warrington y G. C. Weston. 1.990, Palmerston North; Nueva Zelanda: Sociedad de Nueva Zelanda para las Ciencias Hortícolas. 576. Beever, D. J. y G. Hopkirk, Fruit development and fruit physiology. Kiwifruit: science and management, ed. I. J. Warrington y G. C. Weston. 1.990, Palmerston North; Nueva Zelanda: Sociedad de Nueva Zelanda para las Ciencias Hortícolas. 576.) Contenido en ascorbato de frutas de diferente variedad de vid para A. deliciosa, 30-400 mg/100 g (Ferguson, A. R., 1.991 Acta Hort. 290: pág. 603-656, Spano, D., et al., 1.997 Acta Hort., 444: pág. 501-506.) mientras que para cultivar 'Hayward' el intervalo indicado es 80-120 mg/100 g (Beever, D. J. y G. Hopkirk, Fruit development and fruit physiology. Kiwifruit: science and management, ed.

I. J. Warrington y G. C. Weston. 1.990, Palmerston North; Nueva Zelanda: Sociedad de Nueva Zelanda para las Ciencias Hortícolas. 576.) . Se indican mayores concentraciones de ascorbato en fruta de, A. arguta, A. chinensis (Muggleston, S., et al., Orchardist, 1.998. 71 (8) : pág. 38-40, Chen, Q. y Q. Chen, Crop Genetic Resources, 1.998 (2) : pág. 3, Coggiatti, S., 1.971 Ital Agr, Oct, . 108 (10) : pág. 935-941) A. chr y santha y A. polygama con niveles muy altos en A. eriantha y A. latifolia (>1% de peso fresco) (Ferguson 1.991 Acta Hort. 290: pág. 603-656 y A. kolomikta (Kola, J. y J. Pavelka, 1.988 Nahrung, . 32 (5) : pág. 513-515) .

Se han propuesto tres rutas de biosíntesis de ácido ascórbico en plantas, una por L-Gal (Wheeler et al., 1.998, Nature 393, 365-369) , otra de mioinositol (Loewus & Kelly, 1.961, Arch. Biochem. Biophys. 95, 483-493; Lorence et al., (2.004) Plant Physiol. 134, 1.200-1.205) y una tercera por ácido Galacturónico (Agius et al., 2.003, Nat Biotechnol 21, 177-81) . La ruta L-Gal transcurre por L-Gal a galactono-1, 4-lactona y por lo tanto a ascorbato (Wheeler et al., 1.998, Nature 393, 365-369) .

Hasta la fecha, se han identificado todos los genes que codifican enzimas, y sus actividades enzimáticas asociadas, para la ruta L-Galactosa y se ha caracterizado al menos parcialmente, excepto para uno, una supuesta enzima que convierte GDP-L-Galactosa en L-Galactosa-1-Fosfato.

Los genes y actividades enzimáticas caracterizados incluyen la GDP-D-Manosa Pirofosforilasa (Conklin, 1.998; Conklin et al., 1.999; Keller et al., 1.999) , la GDP-D-Manosa 3', 5'-Epimerasa (Wolucka et al., 2.001; Wolucka y Van Montagu, 2.003; Watanabe et al., 2.006) , la L-Galactosa-1-P Fosfatasa (Laing et al., 2.004; Conklin et al., 2.006) , L-Galactosa Deshidrogenasa (Wheeler et al., 1.998; Gatzek et al., 2.002; Laing et al., 2.004) y L-Galactono-1, 4-lactona Deshidrogenasa (Imai et al., 1.998; Bartoli. et al., 2.005) .

La enzima faltante, que (para el mayor conocimiento del solicitante) no se ha indicado que se haya ensayado como una actividad de enzima extraída o purificada o como un gen expresado, cataliza la segunda etapa comprometida para la biosíntesis de ácido ascórbico.

Se identificó el mutante VTC2 de Arabidopsis thaliana en una investigación de resistencia al ozono y también se caracterizó que mostraba niveles de ácido ascórbico especialmente bajos (Conklin et al., 2.000) . Se clonó el gen mutado usando una propuesta basada en mapas (Jander et al., 2.002) y se identificó como un gen (At4g26850) que codifica una nueva proteína. Sin embargo, se indicó que este gen no mostraba homología con otros genes en Arabidopsis excepto para el At5g55120 no caracterizado de manera similar y otros genes no caracterizados de otras especies. Se indicó que la proteína codificada era lo más similar a la proteína MC015.7 de Arabidopsis, la proteína C10F3.4 de Caenorhabitis elegans y la proteína CG3552 de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) , ninguna de las cuales ha demostrado función.

Aunque se indicó que el gen de Arabidopsis (At Ag26850) complementaba cuatro alelos del mutante VTC2, no se proporcionaron detalles (Jander et al., 2.002) . Además los autores comentaron que “aunque tenemos un fenotipo asociado a mutaciones en VTC2, la rutas reguladoras o biosintéticas que conducen a los niveles reducidos de vitamina C en estos mutantes permanecen sin descubrir”.

La identificación de genes que codifican enzimas en la ruta biosintética para la producción de ascorbato proporciona la oportunidad de propuestas basadas en genes para la manipulación del contenido en ascorbato de las plantas.

Sin embargo, aunque se han generado plantas transgénicas, o mutantes, con expresión cambiada de diferentes genes en la ruta de la L-Galactosa para muchas de las etapas de la ruta de la L-galactosa de la biosíntesis de ascorbato y la expresión disminuida de los genes (y niveles enzimáticos) puede dar como resultado ascorbato reducido, la sobreexpresión no ha dado como resultado ascorbato aumentado en las hojas (Ishikawa et al., 2.006 y Conklin et al., 2.006) .

Es un objeto de la invención proporcionar composiciones y métodos mejorados para modular la actividad de la GDPL-Galactosa Guaniltransferasa (también conocida como GDP-L-Galactosa fosforilasa) y/o la actividad de la GDP-D-Manosa Epimerasa y/o contenido en ascorbato o en las plantas o al menos proporcionar a la sociedad una elección útil.

Sumario de la invención.

En la presente memoria se describe un método para producir una célula vegetal o planta con actividad de la GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa aumentada (también conocida como GDP-L-Galactosa fosforilasa) , comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o planta con un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 11 o una variante del polipéptido, en el que la variante presenta la actividad de una GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa.

En un caso la variante comprende la secuencia de aminoácidos: AINVSPIEYGHVLLIP (SEC ID Nº 12) . En un caso más la variante comprende la secuencia de aminoácidos: GYNSLGAFATINHLHFQAY (SEC ID Nº 13) . En un caso más la variante comprende las secuencias de las dos: SEC ID Nº 12 y SEC ID Nº 13. En un caso más la variante presenta al menos 60% de identidad de secuencias para un polipéptido con la secuencia

de aminoácidos según una de la SEC ID Nº 1 a 11.

En un caso más el polinucleótido codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de la SEC ID Nº 1a 11. En un caso más la variante presenta al menos 60% de identidad de secuencias para un polipéptido con la secuencia

de aminoácidos de la SEC ID Nº 1. En un caso más el polinucleótido de a) codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1. En un caso más la variante presenta al menos 60% de identidad de secuencias para un polipéptido con la secuencia

de aminoácidos de la SEC ID Nº 6. En un caso más el polinucleótido de a) codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir en una célula vegetal o planta con ascorbato aumentado relativo a una planta de control adecuada no incluyendo una planta con una mutación quede como resultado ascorbato disminuido, comprendiendo el método transformación de una célula vegetal o planta con un polinucleótido que codifica que un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEC ID Nº 1 a 11, o una variante del polipéptido, en el que la variante presenta la actividad de una GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa, y en el que la variante comprende al menos uno de:

a) la secuencia de aminoácidos: AINVSPIEYGHVLLIP (SEC ID Nº 12) ,

b) la secuencia de aminoácidos: GYNSLGAFATINHLHFQAY (SEC ID Nº 13) y

c) una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencias para la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 11.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la célula vegetal o planta se transforma con un polinucleótido que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEC ID Nº 1 a 11.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula vegetal o planta se transforma también con polinucleótido que codifica una GDP-D-Manosa epimerasa.

4. Un método para producir una célula vegetal o planta con contenido en ascorbato aumentado, comprendiendo el método la transformación de una célula vegetal o planta con: a) un polinucleótido que codifica una GDP-D-Manosa epimerasa que comprende al menos uno de: i) la secuencia de aminoácidos : AADMGGMGFIQSNHSVI (SEC ID Nº 36) ,

ii) la secuencia de aminoácidos: GTWKGGREKAPAAFCRK (SEC ID Nº 37) , iii) una secuencia con al menos 70% de identidad de secuencias para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEC ID Nº 25 a 35 y

iv) la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEC ID Nº 25 a 35 y

b) un polinucleótido que codifica una GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa que comprende al menos uno de:

i) la secuencia de aminoácidos: AINVSPIEYGHVLLIP (SEC ID Nº 12) ,

ii) la secuencia de aminoácidos: GYNSLGAFATINHLHFQAY (SEC ID Nº 13) ,

iii) una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencias para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 11 y iv) la secuencia de aminoácidos según una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 11.

5. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia con al menos 78% de identidad para la secuencia según una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 7, en el que el polipéptido es una GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa.

6. Un polipéptido aislado con la actividad de una GDP-L-Galactosa Guaniltransferasa, que comprende una secuencia con al menos 78% de identidad de secuencias para una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de la SEC ID Nº 1 a 7.

7. Una construcción genética que comprende al menos un polinucleótido según la reivindicación 5.

8. Una célula huésped modificada para comprender al menos un polinucleótido según la reivindicación 5 o la construcción según la reivindicación 7.

9. La célula huésped según la reivindicación 8 modificada genéticamente adicionalmente para expresar una GDP-D-Manosa epimerasa.

10. La célula huésped según la reivindicación 8 ó 9 que es una célula vegetal.

11. Una planta, progenie o propágulo de la misma, que comprende la célula vegetal según la reivindicación 10.

FIGURA 19

media media

Línea # ASC si # con ASC si # con

plantas ASC<60-ASC < 60 ASC > 80 ASC > 80

2 6 .44 4 186 1

6 8 0 176 8

8 11 39 9 213 1

16 10 29 .7 174 2

21 5 38 2 149 3

34 9 50 6 152 2

37 4 48 4 0

40 10 49 2 92 3

41 3 42 1 84 1

43 1 47 . 1 0

44 10 40 7 170* 2

fexl 8 51 (±3) 8 0

wt8 8 52 (±4) 7 0

FIGURA 20