Un método para transformar una planta dicotiledónea, que comprende (a) cortar la plántula dicotiledónea en la intersección del tallo en la que se encuentran los cotiledones de la plántula para producir una plántula decapitada,

(b) someter a agitación vorticial a la plántula decapitada en una suspensión de bacteria que comprende un plásmido de transformación que porta un ADN de transferencia deseado y una sustancia abrasiva, (c) cultivar al menos un brote de la plántula decapitada, (d) cultivar una plántula a partir del brote y (e) identificar una planta que está transformada de forma estable con el ADN de transferencia deseado, en el que dicha planta es una planta dicotiledónea transformada

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para transformación de plantas. Un método tal implica (i) realizar 5 una extirpación en una plántula en el punto en el que se encuentran los dos cotiledones, (ii) exponer la plántula decapitada resultante a una bacteria transformadora que porta un ADN de transferencia tal como Agrobacterium y (iii) explorar nuevos brotes que emergen de la superficie de corte, o plantas o descendencia derivadas de los mismos, para detectar la presencia de al menos parte del ADN de transferencia.

ANTECEDENTES 10

La legumbre de forraje alfalfa (Medicago sativa) tiene un alto valor nutricional y bajo contenido en fibra y, por consiguiente, es un alimento de granja importante. Rasgos tales como estos, así como otros, pueden mejorarse por técnicas de transformación de plantas convencionales. Con respecto a esto, los métodos convencionales de transformar alfalfa se basan típicamente en infectar explantes de hoja de alfalfa a partir de clones altamente regenerables para producir plantas de alfalfa transformadas (Bingham, Crop Sci. 31: 1098, 1991; Austin, et al., Euphytica, 85: 381-393, 15 1995). Estos métodos, sin embargo, requieren múltiples etapas de manipulación, tales como selección, embriogénesis somática y regeneración, que demuestran requerir trabajo intenso, consumir tiempo y ser costosas.

Además, los métodos de transformación convencionales típicamente introducen ADN ajeno en el genoma de la alfalfa de forma permanente. Dicho ADN ajeno generalmente incluye genes marcadores seleccionables, regiones límite de ADN-T de Agrobacterium prolongadas y elementos reguladores de orígenes virales y bacterianos. La presencia de 20 ADN ajeno en alimentos destinados para consumo humano puede provocar preocupación en algunos. Por esta razón, Rommens et al. en la publicación de patente de Estados Unidos nº de serie 2003/0221213, fueron los primeros en proponer el enfoque completamente nativo de la ingeniería genética. En este enfoque, sólo se introduce mediante técnicas de ingeniería genética ADN del genoma del organismo de interés o ADN al que el organismo de interés puede acceder a través de reproducción de forma natural. Las plantas obtenidas a través de este nuevo proceso de 25 reproducción vegetal no contienen ácido nucleico ajeno sino que contienen solamente ácido nucleico de la especie vegetal seleccionada para transformación o plantas que son sexualmente compatibles con la especie de planta seleccionada. Plantas de patata (Solanum tuberosum) que presentan tolerancia mejorada a mancha negra interna representan plantas generadas a través de ingeniería genética solamente con ADN nativo obtenido del genoma de la patata. Las herramientas que se desarrollaron para este fin incluyen transformación eficaz sin marcador y remplazo de 30 elementos genéticos ajenos implicados en transferencia y expresión génica por secuencias de ADN de la especie de planta diana.

De forma interesante, pueden conseguirse diversas mejoras importantes para la alfalfa modificando la expresión de genes endógenos y, de este modo, no se requerirían genes ajenos. Por ejemplo, se ha mostrado que una expresión reducida de los genes de la o-metiltransferasa del ácido cafeico endógena (Comt) o 3-O-metiltransferasa de 35 cafeoil CoA (Ccomt) desencadenaron disminuciones de hasta el 30% en contenido de lignina y, en consecuencia, mejoraron el valor nutricional del forraje de alfalfa (Guo et al., Plant Cell 13: 73-88, 2001; Guo et al., Transgenic Res 10: 457-464, 2001), reduciendo al mismo tiempo la cantidad de producto secundario de estiércol de desecho. La disponibilidad de los métodos de transformación de ADN completamente nativo haría posible mejorar la cosecha de alfalfa respondiendo al mismo tiempo a preocupaciones públicas clave. El desarrollo de tales métodos se describe en 40 este documento, así como la explotación de estos métodos para reducir el contenido de lignina en plantas de alfalfa intragénicas.

El documento WO 2003/079765 proporciona métodos optimizados para producir plantas transgénicas. El documento EP-A2-0267159 se refiere a procesos para la modificación genética de plantas monocotiledóneas. El documento WO 2002/036786 proporciona métodos para seleccionar promotores vegetales para controlar la expresión 45 de transgenes.

SUMARIO

La invención proporciona un método para transformar una planta dicotiledónea, que comprende (a) cortar la plántula dicotiledónea en la intersección del tallo donde se encuentran los cotiledones de la plántula para producir una plántula decapitada, (b) someter a agitación vorticial la plántula decapitada en una suspensión de bacteria que 50 comprende un plásmido de transformación que porta un ADN de transferencia deseado y una sustancia abrasiva, (c) cultivar al menos un brote de la plántula decapitada, (d) cultivar una planta del brote y (e) identificar una planta que está transformada de forma estable con el ADN de transferencia deseado, en el que dicha planta es una planta dicotiledónea transformada.

El método puede comprender adicionalmente cultivar una planta que está transformada de forma estable con el 55 ADN de transferencia deseado o una parte del mismo de modo que produce semilla y después explorar las plantas de progenie cultivadas a partir de esas semillas para identificar las plantas de progenie que también están transformadas

de forma estable con el ADN de transferencia deseado o la parte del mismo.

En una realización, los cotiledones se extirpan de la plántula en la localización de la plántula en la que se encuentran las bases de cada cotiledón. En una realización, la plántula tiene dos cotiledones. En otra realización, los dos cotiledones se extirpan de la plántula en el punto en el que se encuentran los dos cotiledones.

En otra realización, los tejidos aéreos de la planta cultivados a partir de la plántula se transforman de forma 5 estable con el ADN de transferencia deseado o la parte del mismo.

En una realización, el plásmido de transformación usado en tales métodos comprende un ADN de transferencia deseado que consiste esencialmente en secuencias de ADN que son nativas para la especie de la planta que se tiene que transformar o especies que son sexualmente compatibles con las especies diana.

En una realización preferida, la plántula se obtiene permitiendo que una semilla estéril germine durante de 10 aproximadamente uno a aproximadamente ocho días.

En otra realización de este método, se realiza una escisión en una parte de la plántula. Es decir, una parte de la plántula se corta de forma tal que la plántula es capaz de producir un nuevo brote en la superficie cortada. Esta escisión retira los tejidos por encima de la posición en la que se encuentran los dos o más cotiledones e incluye al menos parte tanto de los cotiledones como de las hojas unifoliadas iniciales. En una realización preferida, por lo tanto, la 15 plántula se corta en el sitio en el que se encuentran los cotiledones de forma que los cotiledones y las hojas unifoliadas iniciales se cortan y retiran o de otra manera se "extirpan" de la planta.

De acuerdo con la presente invención, puede ser deseable extirpar los dos cotiledones de alfalfa en su base donde cada uno de ellos se encuentra, que es típicamente en la región más gruesa del tallo. Las extirpaciones que se realizan demasiado lejos por debajo de esa región en el tallo podrían evitar u obstaculizar la formación de brotes 20 nuevos, mientras que el corte de los cotiledones en un punto demasiado alto por encima de la base de los cotiledones podría reducir el alcance de la transformación estable de la plántula con el ADN deseado.

En una realización, la plántula puede ser de cualquier especie vegetal. En una realización, la plántula es de una legumbre. En una realización, la legumbre se selecciona entre el grupo que consiste en alfalfa, guisante, semilla de soja, cacahuete, garbanzo y Medicago troncatula. En una realización preferida, la plántula es de alfalfa, colza o 25 remolacha azucarera. En una realización más preferida, la plántula es de alfalfa.

En otra realización preferida, la plántula de otra planta dicotiledónea, tal como algodón, tabaco, tomate, patata, remolacha azucarera, brócoli, mandioca, batata, pimiento, flor de pascua, semilla de soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, geranio o cactus.

En una realización,...

1. Un método para transformar una planta dicotiledónea, que comprende (a) cortar la plántula dicotiledónea en la intersección del tallo en la que se encuentran los cotiledones de la plántula para producir una plántula decapitada, (b) someter a agitación vorticial a la plántula decapitada en una suspensión de bacteria que comprende un plásmido de transformación que porta un ADN de transferencia deseado y una sustancia abrasiva, (c) cultivar al menos un brote de 5 la plántula decapitada, (d) cultivar una plántula a partir del brote y (e) identificar una planta que está transformada de forma estable con el ADN de transferencia deseado, en el que dicha planta es una planta dicotiledónea transformada.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la identificación de una planta dicotiledónea que está transformada de forma estable con el ADN de transferencia es por exploración únicamente de aproximadamente el 25% de las plantas que tienen un desarrollo y/o crecimiento retardado si se compara con el 75% restante de las plantas. 10

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la plántula es una plántula de alfalfa, guisante, soja, cacahuete, garbanzo, colza, remolacha azucarera, trébol, algodón y Medicago troncatula.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la plántula es una plántula de alfalfa.

5. El método de la reivindicación 4, en el que ambos cotiledones se extirpan de la plántula en la parte más gruesa del tallo de la plántula donde se encuentran los cotiledones. 15

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ADN de transferencia deseado es un ADN-P o un ADN-T que consiste esencialmente solamente en secuencias de ácido nucleico que son nativas del genoma de la especie de la plántula o nativas de una especie que es sexualmente compatible con la plántula.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente (a) cultivar la planta para producir semillas, (b) cultivar plantas de progenie de esas semillas y (c) identificar esas plantas de progenie 20 que se transforman de forma estable con el ADN de transferencia deseado, en el que dichas plantas son plantas de progenie transformadas.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la plántula se germina durante de uno a ocho días antes de la retirada del cotiledón.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la bacteria se selecciona del grupo 25 que consiste en Agrobacterium, Rhizobium y Phyllobacterium.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, Phyllobacterium myrsinacearum, Sinorhizobium meliloti y Mesorhizobium loti.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha sustancia abrasiva es arena, 30 triquitos o partículas de vidrio.